LMP1基因特異性沉默對(duì)GT38細(xì)胞影響的初步研究.pdf

1、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)屬皰疹病毒γ亞科，是重要的DNA腫瘤病毒，與鼻咽癌(NPC)、Burkitt淋巴瘤(BL)、胃癌(GC)等多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。在EBV編碼基因中，潛伏膜蛋白1(Latent membrane protein 1，LMP1)編碼基因已被確認(rèn)具有癌基因的功能。研究表明，LMP1具有介導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化，以及促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)活性。 siRNA是一種

2、短片段雙鏈RNA分子，能以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA，從而高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型。因此采用siRNA技術(shù)深入探討LMP1的生物活性對(duì)于揭示EBV致癌機(jī)制以及開(kāi)展EBV相關(guān)腫瘤的特異性治療具有實(shí)際意義。 本研究選擇EBV陽(yáng)性胃上皮細(xì)胞GT38作為靶細(xì)胞，采用人工合成的siRNA特異性阻斷LMP1的表達(dá)，檢測(cè)LMP1沉默對(duì)GT38增殖和凋亡的影響，探討LMP1在EBV

3、相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，為EBV相關(guān)腫瘤的生物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的:探討化學(xué)合成小干涉RNA(small interfering RNA，siRNA)對(duì)EBV陽(yáng)性胃上皮細(xì)胞(GT38)LMP1編碼基因表達(dá)的抑制作用以及對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法: ①.采用脂質(zhì)體法分別以20、30、50、80和100nM終濃度熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA(FAM-siRNA)轉(zhuǎn)染GT38細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12h內(nèi)用倒置熒光顯

4、微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。 ②.化學(xué)合成靶向LMP1 mRNA 649、979和1348位點(diǎn)的3對(duì)siRNA，以EBVⅢ型潛伏的胃上皮細(xì)胞GT38為靶細(xì)胞，采用脂質(zhì)體法分別將3組siRNA轉(zhuǎn)染GT38細(xì)胞，同時(shí)設(shè)非特異性對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。采用RT-PCR和Western blotting檢測(cè)靶基因LMP1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，篩選出抑制效果最為理想的siRNA鏈并檢測(cè)對(duì)LMP1表達(dá)影響的時(shí)效關(guān)系。 ③.選擇抑制效果最好的siRNA鏈以最

5、佳轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，采用Hoechst 33258、透射電鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GT38細(xì)胞凋亡和周期的變化；Western blotting檢測(cè)LMP1沉默對(duì)GT38細(xì)胞、細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)NFκB基因表達(dá)的影響；RT-PCR檢測(cè)對(duì)Bcl-2、Bax、MMP9、ICAM-1轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。 結(jié)果: ①.FAM-siRNA轉(zhuǎn)染GT38細(xì)胞后12h各濃度組在熒光顯微鏡下均可觀察到細(xì)胞內(nèi)有點(diǎn)狀綠色熒光出現(xiàn)，表明轉(zhuǎn)染成功。siRN

6、A終濃度為50，80和100nM時(shí)轉(zhuǎn)染效率較高，本實(shí)驗(yàn)選用50nM濃度siRNA轉(zhuǎn)染GT38細(xì)胞。 ②.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA的細(xì)胞相比，siRNA649、siRNA979和siRNA1348對(duì)靶細(xì)胞LMP1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均具有抑制作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=235.99，P<0.05)；其中以siRNA649對(duì)LMP1轉(zhuǎn)錄表達(dá)的抑制作用最為明顯，轉(zhuǎn)染后24，48和72h時(shí)LMP1mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均明

7、顯低于細(xì)胞對(duì)照組(F=89.93，P<0.05)，而轉(zhuǎn)染后48和72h時(shí)LMP1mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平明顯低于轉(zhuǎn)染后24h時(shí)LMP1mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。Western blotting結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照比較，轉(zhuǎn)染siRNA649后48h未檢測(cè)到LMP1的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后72和96h時(shí)LMP1的表達(dá)明顯減弱。 ③.Hochest 33258染色可見(jiàn)siRNA649作用后的GT38細(xì)胞發(fā)生凋亡，透射電鏡觀察到GT38細(xì)胞線粒體空泡

8、化，染色質(zhì)固縮；而轉(zhuǎn)染非特異性對(duì)照siRNA的GT38細(xì)胞未觀察到上述改變。流式細(xì)胞分析顯示，與非特異性對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組比較，siRNA649作用24，72以及120h后的細(xì)胞其細(xì)胞周期無(wú)明顯改變。 ④.Western blotting結(jié)果顯示與細(xì)胞對(duì)照比較，siRNA649轉(zhuǎn)染后GT38細(xì)胞總蛋白和核蛋白中NFκB的表達(dá)水平降低，細(xì)胞漿蛋白中NFκB表達(dá)水平增高。 ⑤.RT-PCR檢測(cè)Bcl-2、Bax、MMP9和C

9、AM-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，電泳結(jié)果顯示與細(xì)胞對(duì)照比較，轉(zhuǎn)染后24，48和72h GT38細(xì)胞Bcl-2(F=39.83，P<0.05)、MMP9(F=177.47，P<0.05)、ICAM-1(F=467.69，P<0.05)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯下調(diào)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)Bax的轉(zhuǎn)錄表達(dá)無(wú)明顯影響(F=0.75，P>0.05)，Bcl-2/Bax比值降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.45，P<0.05)。 結(jié)論:化學(xué)合成siRNA能