MicroRNA-31對(duì)E1A激活基因阻遏子基因表達(dá)及血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用研究.pdf

1、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)由分化表型向去分化表型的過(guò)程,即表型轉(zhuǎn)化,是動(dòng)脈粥樣硬化及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后再狹窄等疾病發(fā)生過(guò)程中新生內(nèi)膜形成和管腔狹窄的重要病理基礎(chǔ)。因此,對(duì)VSMCs表型轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究是增生性血管病防治的重要方向。我們前期研究發(fā)現(xiàn)E1A基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是調(diào)控VSM

2、Cs表型轉(zhuǎn)化的重要因子,在臨床經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后再狹窄的防治研究中具有潛在重要意義。但是,調(diào)控CREG基因表達(dá)的上游信號(hào)分子尚未闡明。近年研究發(fā)現(xiàn),一類內(nèi)生的、非編碼小RNA—microRNA(miRNA,miR)在基因表達(dá)調(diào)控方面具有重要作用。它們能夠負(fù)性調(diào)節(jié)靶基因表達(dá),在細(xì)胞分化、增殖等過(guò)程中起到重要作用,是基因調(diào)控領(lǐng)域的一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)和突破口。本研究嘗試尋找調(diào)節(jié)CREG表達(dá)的miRNA,探索并初步闡明其與CREG所介導(dǎo)的VSM

3、Cs表型轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系。
　　研究方法:①應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析,尋找可能調(diào)節(jié)CREG的miRNAs;②應(yīng)用體外培養(yǎng)的人VSMCs為模型,分別用血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF)刺激及去血清饑餓兩種方法處理,建立血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?③應(yīng)用蛋白印跡法(western blot)方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法,檢測(cè)預(yù)測(cè)miRNAs、CREG和VSM

4、Cs表型轉(zhuǎn)化標(biāo)記物(SMα-actin、calponin)在表型轉(zhuǎn)化模型中的表達(dá),探索其是否存在相關(guān)性;④根據(jù)檢測(cè)結(jié)果篩選出可能與CREG的表達(dá)及VSMCs表型轉(zhuǎn)化相關(guān)的miRNA—miR-31,應(yīng)用miR-31的激活劑和抑制劑干預(yù)VSMCs中miR-31的表達(dá),并用westernblot和qRT-PCR方法檢測(cè)CREG及表型轉(zhuǎn)化標(biāo)記物(SMα-actin、calponin)的表達(dá)變化;⑤應(yīng)用雙熒光報(bào)告基因的方法,在人胚腎293細(xì)胞(H

5、uman Embryonic Kidney 293 cells,HEK293細(xì)胞)中檢測(cè)miR-31是否與CREGmRNA3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslatedregions,3’-UTR)直接結(jié)合;⑥應(yīng)用CREG低表達(dá)的VSMCs模型,轉(zhuǎn)染miR-31抑制劑,觀察miR-31對(duì)VSMCs表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控;⑦收集100例人血清,分為正常人組(n1=37)、普通冠心病組(n2=31)、藥物涂層支架后再狹窄組(n3=32)三組,檢測(cè)血

6、清中miR-31的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:①PDGF處理組、去血清處理組與其對(duì)照組比較,VSMCs分化標(biāo)記物(SMα-actin、calponin)在分化型VSMCs中表達(dá)顯著性增加,在去分化型VSMCs中表達(dá)顯著減少,提示VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化(P<0.05);②PDGF處理組、去血清處理組與其對(duì)照組比較,CREG在分化表型VSMCs中表達(dá)顯著增加,在去分化表型VSMCs中表達(dá)下降;而miR-31表達(dá)與CREG相反,在去分化表型V

7、SMCs中表達(dá)增加,在分化表型中減少,提示miR-31與CREG及VSMCs表型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)(P<0.05)。③miR-31激活劑組VSMCs中,SMα-actin、CREG蛋白表達(dá)在激活劑組中顯著減少;而miR-31抑制劑組中,SMα-actin、CREG蛋白的表達(dá)均顯著增加,同時(shí),細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)miR-31激活劑組細(xì)胞是去分化表型,miR-31抑制劑組細(xì)胞向分化表型轉(zhuǎn)化,提示miR-31可調(diào)節(jié)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化和CREG的表達(dá)變化

8、(P<0.05);④進(jìn)一步雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-31可明顯抑制CREG3’-UTR報(bào)告基因的表達(dá),CREG為miR-31的直接靶基因(P<0.05);⑤CREG低表達(dá)+miR-31抑制劑組、miR-31抑制劑組與對(duì)照組比較,SMα-actin蛋白在CREG低表達(dá)組中表達(dá)增加幅度顯著減少,在單獨(dú)miR-31抑制劑組中表達(dá)顯著增加,提示miR-31對(duì)表型轉(zhuǎn)化的作用主要是通過(guò)其靶基因CREG介導(dǎo)的(P<0.05);⑥支架后再狹窄