Bcr基因綠色熒光蛋白表達載體的構建及對K562細胞的影響.pdf

1、研究背景與目的:目前有實驗研究表明Bcr是bcr/abl的負調控基因,其表達可以抑制P210bcr/abl蛋白功能,Bcr蛋白的第354氨基酸絲氨酸磷酸化是Bcr抑制bcr/abl活性的關鍵,另外,在Bcr基因部分,存在一個GRB2的SH2結合位點,該位點的Tyr177磷酸化后,可以誘導Gab2磷酸化,進而導致RAS通路的激活,參與了細胞的增殖.為了證實Bcr對bcr/abl的負調控作用機制,我們構建了短片斷的Bcr基因的真核表達載體,

2、并包含Bcr蛋白的第354位氨基酸絲氨酸磷酸化位點;以目的基因轉染K562細胞后,觀察目的基因對K562細胞增殖與凋亡的影響,是否具有Bcr全長基因的功能,如能獲得穩(wěn)定轉染的細胞株,將為后續(xù)的Bcr基因和Bcr與bcr/abl基因相互作用打下基礎,并驗證我們曾提出的理論假設之一:bcr/abl在正常造血干細胞中表達、誘導Bcr表達或表達增高,通過Bcr表達或高表達誘導bcr/abl表達陽性的造血干細胞發(fā)生凋亡,揭示CML病程演進中的分子

3、機理,同時為CML的分子靶治療提供理論依據(jù).方法:從健康人外周血中分離單個核細胞,采用PCR法克隆目的基因Bcr片斷,構建在哺乳動物細胞中表達的帶有Bcr基因綠色熒光蛋白融合表達載體pEGFP-Bcr系統(tǒng);采用脂質體轉染技術介導重組Bcr基因在k562細胞表達;熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀(FACS)檢測轉染效果和轉染率.G418篩選轉染的陽性克隆(轉染空載體PEGFP-N1的K562細胞命名為K562control,轉染PEGFP-Bc

4、r命名為K562eGFP-bcr);Western-Blot鑒定K562eGFP-bcr基因表達蛋白;MTT法測定K562control和K562eGFP-bcr細胞增殖能力.Annexin-V/PI雙染實驗、流式細胞儀、Heoechst33258染色后及DNAladder方法檢測K562control和K562eGFP-bcr細胞凋亡情況.結論:該研究通過構建帶有短片斷的Bcr功能基因增強型綠色熒光蛋白表達載體,轉染短片斷Bcr目的基