積雪草酸對(duì)糖尿病大鼠腎臟線粒體保護(hù)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要因?yàn)?。越來越多的證據(jù)表明，線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡均參與在糖尿病腎病的發(fā)病過程。積雪草酸(asiatic acid，AA)是積雪草提取物中的五環(huán)三萜烯類組分，具有清除自由基、保護(hù)線粒體的作用，但有關(guān)AA對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。本研究通過鏈脲佐菌素(streptozotocin，ST

2、Z)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型觀察AA對(duì)其腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　 方法：腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，并將糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為糖尿病非干預(yù)組(DM組)、AA干預(yù)組(AA+DM組)[又分為：AA低劑量組(AA1+DM組)、AA中劑量組(AA2+DM組)和AA高劑量組(AA3+DM組)]以及α—硫辛酸(α—lipoic acid，α—LA)干預(yù)組(陽(yáng)性對(duì)照組)(α—LA+DM組)，以正常大鼠為正常對(duì)照組(NC組)。連續(xù)給藥8周

3、后觀察各組大鼠血糖(Blood glucose，BG)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen，BUN)、血肌酐(Serum Creatinine，SCr)、尿白蛋白排泄率(urinary albumin excrection rate，UAER)；光鏡觀察腎臟病理形態(tài)學(xué)改變，電鏡觀察腎臟線粒體形態(tài)改變；檢測(cè)腎皮質(zhì)中丙二醛(malondiadehyde，MDA)的含量、超氧化物岐化酶(superoxidedismutase，S

4、OD)的活性；2’，7’—二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH—DA)熒光探針檢測(cè)各組大鼠腎臟活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成；原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡；檢測(cè)腎臟線粒體膜電位、腫脹度和ATP含量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、Western blotting法檢測(cè)腎臟線粒體電壓依賴性陰離子通道(voltage—dependent anionchannel，VDAC)的表達(dá)；Western blo

5、tting法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C(cytochrome C，CytC)的表達(dá)；免疫組化法檢測(cè)腎臟聚ADP—核糖多聚酶(poly—ADP—ribose polymerase，PARP)的表達(dá)；Westernblotting法檢測(cè)腎臟凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶3(Caspase—3)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．與NC組相比，DM組BG、BUN、SCr、UAER均明顯升高(均P<0．01)；與DM組相比，AA+DM組和

6、α—LA+DM組BUN、SCr、UAER明顯下降(P<0．05或P<0．01)；與AA1+DM組相比，AA3+DM組BUN明顯下降(P<0．01)，其中AA3+DM組與α—LA+DM組BUN、SCr、UAER水平相近；DM組、AA+DM組、α—LA+DM組的BG水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2．光鏡顯示DM組發(fā)生糖尿病腎病的病理改變，電鏡顯示DM組線粒體腫脹，嵴減少。AA+DM組上述形態(tài)學(xué)異常均有改善，其中AA3+DM組最明顯，且與

7、α—LA+DM組的改變相差不大。
　　 3．與NC組相比，DM組腎皮質(zhì)MDA水平明顯升高、SOD活性明顯下降(均P<0．01)；與DM組相比，AA+DM組和α—LA+DM組腎皮質(zhì)MDA水平明顯下降、SOD活性明顯上升(P<0．05或P<0．01)。AA1+DM組、AA2+DM組、AA3+DM組MDA水平呈下降趨勢(shì)、SOD活性呈上升趨勢(shì)，其中AA3+DM組與α—LA+DM組的MDA水平、SOD活性相近。
　　 4．與NC組

8、相比，DM組腎皮質(zhì)ROS熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；AA+DM組和α—LA+DM組腎皮質(zhì)ROS熒光強(qiáng)度較DM組減弱，其中AA3+DM組與α—LA+DM組ROS熒光強(qiáng)度最弱。
　　 5．與NC組相比，DM組腎臟凋亡細(xì)胞數(shù)明顯上升(P<0．01)；與DM組相比，AA+DM組和α—LA+DM組腎臟凋亡細(xì)胞數(shù)明顯下降(P<0．05或P<0．01)；與AA1+DM組相比，AA2+DM組、AA3+DM組腎臟凋亡細(xì)胞數(shù)明顯下降(均P<0．01)，其中A

9、A3+DM組與α—LA+DM組腎臟凋亡細(xì)胞數(shù)相近。
　　 6．與NC組相比，DM組腎臟線粒體膜電位、ATP含量均明顯降低(均P<0．01)，線粒體腫脹度趨勢(shì)明顯減弱；與DM組相比，AA+DM組和α—LA+DM組腎臟線粒體膜電位、ATP含量明顯上升(P<0．05或P<0．01)，線粒體腫脹度趨勢(shì)增強(qiáng)。AA1+DM組、AA2+DM組、AA3+DM組腎臟線粒體膜電位、ATP含量呈上升趨勢(shì)，線粒體腫脹度趨勢(shì)逐漸增強(qiáng)，其中AA3+DM組與

10、α—LA+DM組腎臟線粒體膜電位、ATP含量、腫脹度趨勢(shì)均相近。
　　 7．與NC組相比，DM組線粒體VDAC mRNA和蛋白水平明顯降低(均P<0．01)；AA+DM組和α—LA+DM組VDAC mRNA和蛋白水平較DM組明顯上升(P<0．05或P<0．01)。AA1+DM組、AA2+DM組、AA3+DM組VDAC mRNA和蛋白水平有上升趨勢(shì)，其中AA3+DM組與α—LA+DM組VDAC mRNA水平和蛋白水平均相近。

11、>　　 8．與NC組相比，DM組線粒體凋亡相關(guān)蛋白CytC水平明顯上升(P<0．01)；AA+DM組和α—LA+DM組CytC水平較DM組明顯下降(P<0．05或P<0．01)。AA1+DM組、AA2+DM組、AA3+DM組CytC水平有下降趨勢(shì)，其中AA3+DM組與α—LA+DM組CytC水平相近。
　　 9．與NC組相比，DM組PARP水平明顯上升(P<0．01)；AA+DM組和α—LA+DM組PARP水平較DM組明顯下降

12、(P<0．05或P<0．01);與AA1+DM組相比，AA3+DM組PARP水平明顯下降(P<0．05)，AA3+DM組與α—LA+DM組PARP水平相近。
　　 10．與NC組相比，DM組線粒體凋亡相關(guān)蛋白Caspase—3水平明顯上升(P<0．01)；AA+DM組和α—LA+DM組Caspase—3水平較DM組明顯下降(P<0．05或P<0．01)。AA1+DM組、AA2+DM組、AA3+DM組Caspase—3水平有下降趨