清毒片及hTERT mRNA反義核酸對急性白血病影響的研究.pdf

1、本課題通過文獻、臨床及實驗三個環(huán)節(jié)探討了清毒片及人端粒酶逆轉錄酶基因(hTERTmRNA)反義核酸對急性白血病的影響，以期獲得治療急性白血病的新途徑。 1文獻研究 1.1目的：為本課題研究提供理論依據(jù)。 1.2方法：通過復習文獻，分析總結了端粒酶、hTERT、反義核酸與急性白血病關系及中醫(yī)藥治療急性白血病作用機理。 1.3結果： 1.3.1端粒酶的激活是惡性腫瘤發(fā)生過程中的一個重要環(huán)節(jié)；hTERT

2、是調節(jié)端粒酶活性高低的限速決定因子；急性白血病及其細胞株存在端粒酶活性和hTERTmRNA的高表達情況。抑制端粒酶活性可作為抗白血病的新途徑。 1.3.2反義核酸可與目的基因的特定序列相結合，抑制、封閉或破壞靶基因，干擾遺傳信息從核酸向蛋白質的傳遞。以hTERTmRNA為靶點的反義核酸可抑制端粒酶活性。 1.3.3中醫(yī)藥在誘導凋亡、誘導分化、逆轉耐藥、介導免疫調節(jié)及調控基因表達等方面發(fā)揮抗急性白血病的作用。 1.

3、4結論：中藥和反義核酸均能調控基因表達，故理論上中藥同hTERTmRNA反義核酸聯(lián)合應用有可能得到抗白血病的協(xié)同效應。 2臨床研究 2.1第一節(jié)：急性白血病患者中醫(yī)證型與hTERTmRNA表達關系的研究 2.1.1目的：探討急性白血病患者hTERTmRNA表達的中醫(yī)本質，為尋找合理的中藥干預hTERTmRNA表達提供理論依據(jù)。 2.1.2方法：采用半定量RT-PCR法檢測了29例不同證型急性白血病患者外周

4、血單個核細胞hTERTmRNA表達的異同，以20例正常人作對照。 2.1.3結果：急性白血病患者hTERTmRNA表達量明顯高于與正常人，兩組間差異有顯著性意義(P＜0.01)。急性白血病患者中以毒熱熾盛型hTERTmRNA表達量最高，各中醫(yī)證型hTERTmRNA表達量由小到大依次為瘀血痰結型＜氣陰兩虛型＜毒熱熾盛型。毒熱熾盛型和瘀血痰結型比較，有顯著性差異(P＜0.05)。毒熱熾盛型與氣陰兩虛型比較，P=0.05，無統(tǒng)計學意義

5、。氣陰兩虛型與瘀血痰結型比較亦無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 2.1.4結論：與虛、瘀、痰等因素相比，毒可能與hTERT最具有相關性，即hTERTmRNA的高表達反映中醫(yī)“毒”的本質。解毒之法可能可作為干預hTERTmRNA表達，從而治療急性白血病的方法。 2.2第二節(jié)：清毒片對急性白血病患者hTERTmRNA表達影響的研究 2.2.1目的：觀察以解毒法為主的經(jīng)驗藥物清毒片對急性白血病患者hTERTmRNA表達的

6、影響，以證實臨床研究第一節(jié)中“解毒之法可能可以干預hTERTmRNA表達”的推測，并從中西醫(yī)兩個方面探討清毒片治療急性白血病的作用機制，且為分析后續(xù)實驗研究的結論分析提供依據(jù)。 2.2.2方法：將20例毒熱熾盛型和瘀血痰結型急性白血病患者隨機分為觀察組和對照組，每組各10例。對照組按常規(guī)化療方案誘導緩解治療，觀察組在常規(guī)化療方案誘導緩解治療同時加服清毒片，觀察期限為8周。所有患者均于化療前及第8周末檢測外周血象、骨髓象變化及外周

7、血單個核細胞hTERTmRNA的表達。 2.2.3結果：經(jīng)清毒片聯(lián)合化療治療的患者hTERTmRNA表達明顯下降。清毒片聯(lián)合化療在改善外周血象、骨髓象方面優(yōu)于單純化療，其中對貧血的改善作用最為明顯(P＜0.05)。在完全緩解率方面，兩組間比較無顯著性差異(P＞0.05)，可能與樣本數(shù)偏少有關。清毒片聯(lián)合化療在下調hTERTmRNA表達方面明顯優(yōu)于單純化療(P＜0.05)。 2.2.4結論：以解毒法為主清毒片聯(lián)合化療治療急

8、性白血病優(yōu)于單純化療，下調hTERTmRNA的表達可能是清毒片治療急性白血病的作用機制之一。清熱解毒、祛邪安正的功效是清毒片的中醫(yī)作用機制。 3實驗研究 3.1目的：通過臨床研究，我們發(fā)現(xiàn)清毒片下調hTERTmRNA表達可能是其治療急性白血病的作用機制之一。在實驗部分中，我們擬觀察清毒片、hTERT反義核酸、清毒片聯(lián)合hTERT反義核酸對人早幼粒細胞白血病細胞株(HL-60)細胞增殖、細胞凋亡及細胞hTERTmRNA表達

9、的影響，分析產(chǎn)生影響的作用機制；觀察均能影響hTERTmRNA表達的清毒片與反義核酸聯(lián)用是否產(chǎn)生協(xié)同作用，探討清毒片聯(lián)合反義核酸治療急性白血病的可行性，為今后的臨床應用提供實驗依據(jù)。 3.2方法：通過血清藥理學方法制備清毒片小鼠含藥血清；常規(guī)培養(yǎng)HL-60細胞；制備hTERT反義核酸-脂質體復合物；分別將清毒片小鼠含藥血清(清毒片組)、hTERT反義核酸-脂質體復合物(反義核酸組)、清毒片小鼠含藥血清聯(lián)合hTERT反義核酸-脂質

10、體復合物(清毒片加反義核酸組)作用于HL-60細胞，采用MTT法檢測HL-60細胞增殖抑制率，采用細胞形態(tài)學及AnnexinV-FITC/PI雙標記法早期凋亡流式細胞儀檢測細胞凋亡，采用半定量RT-PCR法檢測細胞hTERTmRNA的表達；以蒸餾水小鼠血清作用于HL-60細胞作陰性對照組，對阿糖胞苷作用于HL-60細胞作陽性對照組，以HL-60細胞常規(guī)培養(yǎng)體系作空白對照組。 3.3結果： 3.3.1清毒片及hTERT反義

11、核酸對HL-60細胞增殖抑制的影響 蒸餾水組細胞增殖抑制率與空白對照組接近，兩組間比較無顯著性差異(P＞0.05)；清毒片組對HL-60細胞增殖抑制率較反義核酸組略低，但兩組比較無顯著性差異(P＞0.05)；清毒片聯(lián)合反義核酸對HL-60細胞的增殖抑制作用明顯高于單獨使用清毒片或反義核酸，特別是在第72小時，其組間抑制率比較有顯著性差異(P＜0.05)；對HL-60細胞增殖抑制率從高到低依次為：阿糖胞苷組＞清毒片加反義核酸組＞反

12、義核酸組＞清毒片組＞蒸餾水組；實驗各組還表現(xiàn)出明顯的時間依賴性，即隨著培養(yǎng)時間的延長，對HL-60細胞增殖抑制率升高。 3.3.2清毒片及hTERT反義核酸對HL-60細胞凋亡的影響 3.3.2.1細胞凋亡的形態(tài)學觀察：經(jīng)藥物處理后細胞，光鏡下可見細胞胞體縮小，胞膜完整，胞質中出現(xiàn)空泡，核染色質凝集，核固縮等符合凋亡細胞的改變，而蒸餾水組和常規(guī)培養(yǎng)體系的細胞形態(tài)無變化。 3.3.2.2AnnexinV-FITC/

13、PI雙標記法細胞早期凋亡流式檢測 蒸餾水組與空白對照組三個時間段凋亡率相比較，其差異均無顯著性意義(P＞0.05)；阿糖胞苷組與空白對照組及其余各組三個時間段的凋亡率相比較，其差異均有極顯著性意義(P＜0.01)；清毒片加反義核酸組與反義核酸組及清毒片組相比較，有顯著性差異(P＜0.05)；誘導HL-60細胞凋亡率從高到低依次為：阿糖胞苷組＞清毒片加反義核酸組＞反義核酸組＞清毒片組＞蒸餾水組；實驗各組表現(xiàn)出明顯的時間依賴性，即隨

14、著培養(yǎng)時間的延長，HL-60細胞凋亡率升高；加藥各組凋亡率與空白對照組相比較，有極顯著性差異(P＜0.01)；空白對照組表現(xiàn)較低的凋亡率。 3.3.3清毒片及hTERT反義核酸對HL-60細胞hTERTmRNA表達的影響 蒸餾水組與空白對照組相比較，無顯著性差異(P＞0.05)；加藥各組與空白對照組、蒸餾水組比較，組間差異有極顯著性意義(P＜0.01)；反義核酸組、清毒片加反義核酸組與阿糖胞苷組、清毒片組比較，組間差異有

15、極顯著性意義(P＜0.01)；清毒片加反義核酸組與阿糖胞苷組、清毒片組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)；清毒片加反義核酸組與反義核酸組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。下調程度從高到低依次為：清毒片加反義核酸組＞反義核酸組＞清毒片組＞阿糖胞苷組。 3.4結論：在對HL-60細胞的抑制增殖、誘導凋亡及下調hTERTmRNA表達方面，清毒片與反義核酸聯(lián)合應用具有協(xié)同效應，且表現(xiàn)出明顯的時間依賴性。與阿糖胞苷相比，清毒片聯(lián)合反義