日本血吸蟲DNA疫苗的研究和應(yīng)用.pdf

1、血吸蟲病是一種世界性的傳染性疾病，它危害著人類的生命健康，阻礙社會(huì)發(fā)展。血吸蟲DNA疫苗是預(yù)防血吸蟲疾病的一種新方法，日本血吸蟲的DNA疫苗的研究取得了很大的進(jìn)展。本文克隆了日本血吸蟲的抗原基因；對(duì)抗原基因進(jìn)行基因融合；構(gòu)建日本血吸蟲DNA疫苗；研究了日本血吸蟲DNA疫苗的發(fā)酵工藝，分離純化工藝；研究了日本血吸蟲DNA疫苗在體內(nèi)、體外表達(dá)的可行性。主要取得以下成果：
　　 ⑴克隆了四種日本血吸蟲抗原基因sj23、sjFABP、s

2、jGAPDH、sj26，經(jīng)過酶切、測(cè)序驗(yàn)證陽性克隆子。
　　 ⑵采用融合PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)，構(gòu)建了兩個(gè)融合基因sj23.FABP和sj26.GAPDH。
　　 ⑶亞克隆四種日本血吸蟲抗原基因sj23、sjFABP、sjGAPDH、sj26和兩種日本血吸蟲抗原基因的融合基因sj23.FABP、sj26.GAPDH，插入到真核表達(dá)載體pVIVO2的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建了14種日本血吸蟲DNA疫苗。
　　 ⑷優(yōu)化了日本血吸蟲D

3、NA疫苗的發(fā)酵條件：利用單因子實(shí)驗(yàn)，從5種碳源、6種氮源中最優(yōu)碳源為甘油，最優(yōu)氮源為豆餅汁；最佳K2HPO4添加比例為20%；通過“Plackeet-Burman”實(shí)驗(yàn)從6種發(fā)酵培養(yǎng)基的成份中篩選出3種重要影響因子：豆餅汁，牛肉汁，甘油。通過“Box-Behnken”分析，獲得最佳培養(yǎng)基配方(m/v)：NaCl 1%，YE 1%，磷酸鹽 0.3%（其中K2PO4添加比例為20%），甘油 1.68%，牛肉汁 2.28%，豆餅汁4.21%，

4、初始pH值為7.0。
　　 ⑸建立了日本血吸蟲DNA疫苗的制備工藝：采用凝膠過濾去除RNA和雜蛋白，采用親和離子層析去除開環(huán)質(zhì)粒DNA，采用親和吸附去除內(nèi)毒素。最終產(chǎn)品經(jīng)過質(zhì)量評(píng)價(jià)，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中不可見RNA條帶，雜蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)占0.11%，超螺旋質(zhì)粒DNA含量達(dá)93.4%，總熱源含量為0.85EU/（mg plasmid）。各項(xiàng)指標(biāo)都達(dá)到了國家食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)醫(yī)用級(jí)DNA疫苗的技術(shù)要求。
　　 ⑹通過間接