MiR-26a在子宮肌瘤發(fā)生過程中的作用及對雌激素受體α、孕激素受體a的調控機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 子宮肌瘤是婦女疾病中最常見的良性腫瘤，接近一半35-49歲婦女患有子宮肌瘤，源于子宮平滑肌細胞。經(jīng)常伴隨長期、大量的類似月經(jīng)期的出血，所以會引起中度貧血。此外，一些病例報道還會出現(xiàn)中度到重度的疼痛。子宮肌瘤壓迫導致骨盆不適，腸道和膀胱功能障礙也是非常普遍的現(xiàn)象。更嚴重的是，會影響生育，比如不孕及習慣流產(chǎn)。子宮肌瘤在懷孕期間生長速度非?？欤⒂锌赡芤鹱枞置浔黄冗M行剖腹產(chǎn)，除產(chǎn)后出血外，也可能出現(xiàn)胎兒異常先露和

2、胎兒異常。這些臨床并發(fā)癥嚴重影響了婦女的健康。
　　 子宮肌瘤是雌激素和孕激素依賴性的良性腫瘤。雖然臨床和生物學研究一直以來都認為雌激素是促進子宮肌瘤增長的重要因素，但越來越多的證據(jù)表明孕激素與子宮肌瘤的發(fā)病機理也息息相關。雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)在雌激素介導的致癌過程中都發(fā)生了重要的調控作用，影響了子宮肌瘤細胞的生長。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是一種大小約21-23個堿基的非編碼單鏈小分子

3、RNA，在生物體內發(fā)揮重要作用，包括細胞增殖，凋亡，應激反應和腫瘤發(fā)生。最近研究顯示miRNA在多種腫瘤中的表達水平發(fā)生了變化，可能在某些腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。研究認為miRNA水平的變化常導致其靶基因的表達異常，從而影響了腫瘤的進程。許多腫瘤都涉及到了miRNA的變化，并且其變化程度還與腫瘤的分型分級以及預后密切相關，這提示我們在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮重要作用的miRNA極有可能作為腫瘤治療的新型分子靶標。
　　 Mir-

4、26a在癌變過程中的作用非常復雜，它既可作為癌基因，也能夠成抑癌基因，例如其在成膠質細胞瘤和肝癌中作用恰好相反。在這里我們將子宮肌瘤中ERα、PRa的表達調控和miRNAs聯(lián)系起來進行研究。利用TargetScan分析軟件發(fā)現(xiàn)了mir-26a于ERα、PRa的3'UTR區(qū)存在潛在結合位點。因此我們選擇mir-26a進行深入研究，進一步通過實驗驗證mir-26a對ERα、PRa表達的調控作用并進一步揭示其對子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展的潛在影響。<

5、br>　　 研究方法及結果：
　　 1、實時定量PCR、原位雜交檢測mir-26a在子宮肌瘤組織和其相應子宮肌層組織中的表達情況：
　　 收集15例子宮肌瘤病人的子宮肌瘤組織和相應正常子宮肌層組織，運用RealtimePCR檢測mir-26a在這15例子宮肌瘤和其相應子宮肌層組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)在13例中，子宮肌瘤組織中的mir-26a呈明顯低表達。
　　 接著，用形態(tài)學方法，采用原位雜交檢測15例子宮肌瘤患

6、者的子宮肌瘤組織和相應子宮肌層組織中mir-26a的表達差異，光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)15例病人標本的子宮肌瘤組織中mir-26a表達均明顯低于其在相應子宮肌層組織的表達。
　　 2、采用免疫組化方法檢測子宮肌瘤組織及其相應正常子宮肌層組織中ERα、PRa和一些周期和增殖指標：
　　 隨機選擇長海醫(yī)院婦產(chǎn)科15例經(jīng)臨床診斷和病理診斷證實為子宮肌瘤的病人，年齡33～54歲，前一周內均未接受雌、孕激素及其它激素治療。采用免疫組化法對

7、這15例患者的子宮肌瘤組織和相應正常子宮肌層組織內的ERα、PRa、Ki67、PCNA、CyclinD2和CyclinE2進行檢測，結果顯示，在15對標本中，子宮肌瘤組織和其相應子宮肌層組織中均含有ERα、PRa、Ki67、PCNA、CyclinD2和CyclinE2，肌瘤組織和肌層組織之間的ERα、PRa、Ki67、PCNA、CyclinD2和CyclinE2四個檢測指標陽性率均有明顯差別，肌瘤組織中的ERα、PRa、Ki67、PCN

8、A、CyclinD2和CyclinE2均高于相應正常肌層組織。
　　 3、培養(yǎng)子宮肌瘤原代細胞，在細胞水平驗證mir-26a對ERα、PRa的調控作用：
　　 用長海醫(yī)院婦產(chǎn)科取得的子宮肌瘤病人新鮮標本進行原代培養(yǎng)，成功建立人子宮肌瘤細胞系，為后續(xù)實驗奠定基礎。利用TargetScan分析軟件預測出ERα、PRa為mir-26a的潛在靶基因，并找出含mir-26a結合位點的ERα、PRa的3’UTR區(qū)片段，分別克隆插入結

9、構質粒PmirGLO的綠色熒光蛋白編碼區(qū)下游，構建出新的報告基因載體。引入雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)進行驗證，驗證出ERα、PRa為mir-26a的靶基因。
　　 在此基礎上，將mir-26a的mimics轉入子宮肌瘤細胞中，使其高表達mir-26a，并設立對照，即轉染NC的子宮肌瘤細胞。用westernblot檢測mir-26a的靶蛋白ERα、PRa的表達水平，與對照相比，mir-26a的mimics轉染量不同，ERα、PRa的蛋

10、白水平不同程度下調。
　　 4、Mir-26a對子宮肌瘤細胞周期和增殖的調節(jié)：
　　 為證實mir-26a對子宮肌瘤細胞生物學功能的影響，我們將mir-26a的mimics轉入子宮肌瘤平滑肌細胞中，使其高表達mir-26a，并設立對照，即轉染NC的子宮肌瘤平滑肌細胞，用流式細胞儀分別檢測在24h和48h時細胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)在24h時，高表達mir-26a的細胞與對照組相比，細胞大量滯留在G0/G1期。此外，用cck-8

11、試劑盒檢測mir-26a對細胞增殖的影響，結果顯示細胞種植后的第二天開始，高表達mir-26a的肌瘤平滑肌細胞增殖速度顯著慢于對照組細胞。
　　 結論：
　　 1、子宮肌瘤組織中mir-26a的表達下調，揭示mir-26a的表達與子宮肌瘤之間具有相關性；
　　 2、較其相應的正常肌層組織，子宮肌瘤組織中ERα、PRa、Ki67、PCNA、CyclinD2和CyclinE2表達水平均升高，所以mir-26a和ERα

12、、PRa、Ki67、PCNA、CyclinD2和CyclinE2的表達呈負相關，提示ERα、PRa、Ki67和PCNA、CyclinD2和CyclinE2的表達失調參與子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展有關；
　　 3、成功建立子宮肌瘤平滑肌細胞原代培養(yǎng)方法，為進一步研究子宮肌瘤的功能奠定基礎；
　　 4、構建出含有與mir-26a互補位點的ERα、PRa的3’UTR區(qū)的新報告基因質粒，
　　 并證實mir-26a參與ERα、

13、PRamRNA的轉錄后調控；
　　 5、高表達mir-26a的子宮肌瘤平滑肌細胞，ERα、PRa的蛋白水平下調，mir-26a顯著抑制了ERα、PRa的蛋白表達量，進而有效抑制雌激素、孕激素對子宮肌瘤平滑肌細胞的促增殖作用，提示mir-26a可能成為一項重要的臨床檢測指標；
　　 6、mir-26a的表達水平與子宮肌瘤的增殖和周期密切相關，高表達mir-26a使子宮肌瘤平滑肌細胞周期被阻滯，增殖速度降低，抑制了細胞的分裂