結直腸癌中RegIV生物學效應的研究.pdf

1、結直腸癌是嚴重危害人類健康的常見消化道惡性腫瘤之一。在我國由于結直腸癌的發(fā)病率逐漸增加，并且其發(fā)病年齡趨向低齡化，因此人們對結直腸癌發(fā)生機制的研究日益增加。
　　腺瘤是結直腸癌發(fā)生的早期階段，多數結直腸癌是從腺瘤癌變而來的，因此切除腺瘤可以有效地降低結直腸癌的發(fā)病率。然而，約30％～46％的腺瘤患者在接受治療后2.5～7年內仍會復發(fā)，原因在于目前尚缺乏有效的指標來預測腺瘤的進一步演進或復發(fā)。因此對結直腸腺瘤發(fā)生機制的研究對于結直腸

2、癌的預防及治療具有重大意義。
　　盡管人們對結直腸癌發(fā)生的分子機理進行了大量的研究，但至今結直腸癌的發(fā)生發(fā)展的分子機制仍不清楚。早在1999年，我們實驗室應用抑制性消減雜交法(SSH)（利用一個同時患有結腸腺瘤和腺癌的病例）構建了三個eDNA差減文庫，在對腺瘤相對于正常粘膜的差異片段文庫(A-N)分析時發(fā)現(xiàn)再生基因家族成員RegⅣ在腺瘤中相對高表達。
　　再生基因(Regenerating gene，Reg)家族屬于C型植物

3、血凝素超家族。該基因家族成員，均為小分子量的分泌性蛋白質，在結構上具有相似的鈣離子依賴性血凝素結構域。它們與炎癥、組織損傷/修復、糖尿病及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。迄今為止，已經發(fā)現(xiàn)的人類Reg家族成員一共有3個，即RegⅠ，RegⅢ及RegⅣ。與其他人類Reg家族成員不同的是，RegⅣ定位于第一號染色體上，而其余成員均定位于第二號染色體。但RegⅣ與Reg家族的其他成員在結構及功能上具有相似性。
　　近年來人們已證實RegⅣ與結直

4、腸癌的發(fā)生發(fā)展有關，然而RegⅣ在結直腸癌中的生物學功能及效應機制卻研究的不多。為深入研究RegⅣ在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們開展了以下兩部分研究:RegⅣ在結直腸癌細胞中的生物學功能研究和RegⅣ在結直腸癌細胞中的效應機制研究。
　　首先通過RT-PCR和Western blot方法尋找RegⅣ陰性和陽性表達的結直腸癌細胞系。實驗結果顯示RKO和HT29為RegⅣ陰性表達細胞株，LoVo和CW2為RegⅣ陽性表達細胞株。然后

5、我們分別轉染RegⅣ表達質粒到RegⅣ陰性表達的結直腸癌細胞內，通過G418篩選得到穩(wěn)定表達RegⅣ的細胞克隆，分別記為RKO-RegⅣ細胞株(RKOR)和HT29-RegⅣ細胞株(HT29R)，它們的對照組分別記為RKO-Ctrl（RKOC）和HT29-Ctrl細胞株(HT29C);轉染RegⅣ干擾質粒到LoVo細胞株中，同樣通過G418穩(wěn)篩出RegⅣ穩(wěn)定干擾的細胞克隆LoVo-RegⅣ-shRNA和它的對照組細胞克隆LoVo-Ctr

6、l-shRNA;用siRNA片段瞬時干擾CW2細胞中RegⅣ的表達，它的RegⅣ干擾的細胞記為CW2-siRNA-RegⅣ，對照組細胞記為CW2-siRNA-NC。
　　獲得RegⅣ穩(wěn)定表達/干擾的細胞克隆后，我們對這些細胞克隆進行生物學功能研究，通過EdU法、xCELLigence系統(tǒng)及CCK8方法檢測RegⅣ表達/干擾前后細胞增殖能力變化，未發(fā)現(xiàn)RegⅣ具有促進細胞增殖的能力;通過外源性RegⅣ刺激細胞后同樣發(fā)現(xiàn)RegⅣ未具有

7、促進細胞增殖的能力;我們又利用流式細胞術檢測細胞周期，結果顯示并無顯著差異。利用5-FU誘導細胞凋亡，分別在24小時和48小時檢測細胞的存活率，發(fā)現(xiàn)這幾組細胞的存活率也無明顯差異。通過Transwell小室和xCELLigence系統(tǒng)檢測到RegⅣ表達組細胞的遷移能力均強于它們的對照組細胞;而RegⅣ干擾組細胞的遷移能力比它們的對照組細胞有所下降。利用鋪有Matrigel的Transwell小室檢測細胞的侵襲能力，發(fā)現(xiàn)RegⅣ表達組細胞

8、的侵襲能力強于它們的對照組細胞，干擾組結果反之。綜上可知RegⅣ具有促進結直腸癌細胞遷移和侵襲能力，但未見對結直腸癌細胞的增殖和凋亡有影響。因此探索RegⅣ如何誘導結直腸癌細胞遷移和侵襲的分子機制是我們下一步所要開展的工作。
　　比較蛋白質組學是當今生物學研究的一個重要領域，比較不同生理和病理狀態(tài)下細胞內蛋白質表達和蛋白質修飾，對于揭示生物系統(tǒng)的復雜生理和病理過程具有十分重要的意義。同位素標記相對和絕對定量（isobaric ta

9、gs for relative andabsolute quantitation，iTRAQ）技術是近年來最新開發(fā)的一種新的蛋白質組學定量研究技術。iTRAQ技術結合先進的液相色譜-質譜聯(lián)用儀(liquid chromatography-mass spectrograph，LC-MS)對蛋白質樣本的分離能力強、分析范圍廣、靈敏度高、可同時對多個樣本進行平行分析并可以絕對和相對定量，因此iTRAQ技術結合LC-MS必將成為一種功能更強大的

10、蛋白組學研究方法。
　　因此我們選用iTRAQ標記的比較蛋白組學方法來探索RegⅣ在結直腸癌細胞中的效應機制，我們用該方法完成了對1985種蛋白質的定量分析。已鑒定出的表達量上有差異的蛋白質是否最終被篩選和認定為差異蛋白質，還需要進行統(tǒng)計學的驗證。由于RKO和HT29細胞本身遺傳背景不同，因此它們所得的差異蛋白質結果也存在差異。通過統(tǒng)計學分析后，所產生的差異蛋白質的篩選結果如下:RKOR/RKOC組鑒定出6個顯著下調和11個顯著上

11、調的蛋白質，HT29R/HT29C組鑒定出18個顯著下調和13個顯著上調的蛋白質。因為腫瘤的轉移過程是多基因、多途徑的過程，因此不同遺傳背景的細胞所得的實驗結果可以為RegⅣ分子機制研究提供更多的信息和線索。我們利用GO數據庫對鑒定出的所有差異蛋白進行GO功能注釋分析，利用蛋白相鄰類的聚簇(cluster of Orthologous Groups of proteins，COG)對蛋白質進行直系同源分類，利用KEGG公共數據庫分析、確

12、定蛋白質參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。最后我們用Q-PCR檢測了RKOR/RKOC組中15個差異基因和HT29R/HT29C組18個差異基因的表達情況，其中RKOR/RKOC組中的12個差異基因和HT29R/HT29C組中的14個差異基因的Q-PCR結果與iTRAQ鑒定的結果一致。我們又用Western blot驗證了MRPL12、MAGED2、DBN1、TIP47、MAPK3和S100A11的表達情況，結果均與iTRAQ鑒定