EBV潛伏膜蛋白1(LMP-1)靶向SPIO對鼻咽癌成像的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 制備鼻咽癌細胞表面的標志性抗原潛伏膜蛋白1(Latentmembrane protein1,L,MP1)靶向納米鐵對比劑,并分析靶向納米鐵對比劑對人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型MR分子成像的效果及其意義。
　　 材料與方法:
　　 1.應用共沉淀法制備LMP1靶向對比劑,第一步:由FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O共反應得到納米Fe3O4;第二步:加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropy

2、ltriethoxysilane,APTES),使Fe3O4備表面氨基化,得到Fe3O4-APTES;第三步:將LMP1抗體HA3加入Fe3O4-APTES磁流體中,冰浴過夜,得到LMP1靶向對比劑FeSO4-APTES-H4A3。并對其進行表征檢測。
　　 2.將CNE1-LMP1(細胞膜表面LMP1表達陽性的人鼻咽癌細胞株CNE1)細胞與CNE1(細胞膜表面LMP1表達陰性的人鼻咽癌細胞株CNE1)細胞均調至1×104/ml

3、×105/ml,1×106/ml,1×107/ml,并加入Fe3O4-APTES-H4A3(調至Fe濃度至20ug/ml)共孵育,再進行普魯士藍染色觀察、MRI掃描及透射電鏡檢查。觀察信號變化特征,探索LMP1靶向對比劑對CNE1-LMP1細胞的靶向效應。
　　 3.構建人鼻咽癌皮下雙移植瘤裸鼠模型,方法如下:抽取0.2ml.CNE1-LMP1細胞懸液(密度為1×107/ml),于裸小鼠右側胸壁皮下緩慢推注;再同樣抽取0.2 m

4、l CNE1細胞懸液(密度為1×107/ml),于裸小鼠左側胸壁皮下對稱位置緩慢推注。
　　 15只裸鼠參與制模,其中14只裸鼠雙瘤模型建模成功(成瘤率93.3％),獲得28枚移植瘤腫塊,將其分成2組:實驗腫塊14枚,由CNE1-LMP1細胞株形成,位于裸鼠右側胸壁皮下;對照腫塊14枚,由CNE1細胞株形成,位于同一只裸鼠左側對稱的胸壁皮下。經裸鼠尾靜脈注入Fe3O4-APTES-H4A3并行MR掃描檢查,測量增強檢查前后腫塊的

5、MRI信號強度、計算腫塊的信號變化率。每一枚腫瘤信號強度具體的測定方法為:選擇5個大小一致的感興趣區(qū)域(region ofintrest,ROI),ROI的測定范圍包括腫瘤的全部區(qū)域、邊緣區(qū)以及中央?yún)^(qū),盡量選擇MRI信號均勻區(qū)域,測量并記錄信號強度,然后取其平均值,并計算信號變化率(△SI),△SI=(Sipost-Sipre)/Sipost×100％,其中Sipost為注入靶向對比劑之后的鼻咽癌移植瘤腫塊信號強度,Sipre為MRI平

6、掃時鼻咽癌移植瘤腫塊的信號強度。將所得數(shù)據(jù)結果16.0SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。剝取移植瘤腫塊,制成切片,行免疫組化染色和普魯士藍染色檢查。
　　 結果:
　　 1.對Fe3O4-APTES-H4A3的表征檢查顯示,直徑約28±3nm,形態(tài)規(guī)整,分散均勻,X線衍射分析(X-ray diffraction,XRD)特征波峰及波形符合Fe3O4特征,具備超順磁性。
　　 2.體外實驗結果顯示:
　　 普魯

7、士藍染色顯示CNE1-LMP1細胞內可見大量藍色鐵顆粒存在,CNE1細胞內藍色鐵顆粒明顯減少;
　　 體外MRI成像顯示CNE1-LMP1細胞與Fe3O4-APTES-H4A3共孵育后T2WI信號強度降低,并隨著細胞數(shù)量級的增加T12WI信號呈遞減趨勢,具有統(tǒng)計學意義;CNE1細胞與Fe3O4-APTES-H4A3共孵育后T2WI信號強度亦降低,同時也隨著細胞數(shù)量級的增加T2WI信號梯減,但不具有統(tǒng)計學意義。
　　 3.

8、動物實驗結果:
　　 人鼻咽癌皮下雙移植瘤裸鼠模型構建成功。體內水平MRI成像結果顯示,注射LMP1靶向對比劑(Fe3O4-APTES-H4A3)后CNE1-MP1移植瘤T2WI強度及信號變化率均有明顯下降,具有統(tǒng)計學意義。并計算得出Fe3O4-APTES-H4A3對于CNE1-LMP1移植瘤腫塊的敏感度Sen=85.7％,特異度Spe=71.4％。CNE1移植瘤腫塊T2WI信號強度未見明顯改變。
　　 病理學檢查:免疫

9、組化染色證實所建立的裸小鼠動物模型符合人鼻咽癌細胞。普魯士藍染色顯示CNE1-MP1移植瘤腫塊組織內見大量藍染的鐵顆粒,而對照組幾乎未見鐵顆粒的存在。
　　 結論:
　　 1.通過共沉淀法可構建針對鼻咽癌細胞標志性抗原LMP1的靶向MR對比劑Fe3O4-APTES-H4A3;
　　 2.構建的鼻咽癌潛伏膜蛋白靶向納米鐵MR對比劑(Fe3O4-APTESH4A3)對CNE1-LMP1細胞具備一定的靶向性。