兩種不同來源的細胞外基質微粒支架對人脂肪源性干細胞體內成脂能力的影響.pdf

1、皮下軟組織充填是整形外科常見的治療手段。對于體表的皮下軟組織缺損，凹陷萎縮畸形目前常采用自體游離脂肪或各種人工材料進行充填。人工材料因存在排異反應及安全性問題難以滿足臨床需要，而自體游離脂肪的移植存活率低。脂肪移植物被吸收的原因總結起來可分為兩種：一是成熟脂肪細胞對缺氧損傷的耐受力低，且不容易增殖更新；其二是由于移植脂肪組織的血供不足，導致移植到供區(qū)的脂肪因缺氧而壞死，產(chǎn)生硬結液化。以干細胞為種子細胞，應用組織工程的方法構建脂肪組織，已

2、成為目前人們研究的熱點?，F(xiàn)在應用較多的是骨髓間充質干細胞，但由于其取材困難，來源有限而受到一定限制。最近人們從脂肪組織中分離提取出具有干細胞作用的一種細胞類型，稱為脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells，ASCs)，它具有取材便利、創(chuàng)傷小，不會引起倫理學爭議等優(yōu)點，成為應用前景廣泛的一種可用于自體組織修復和重建的種子細胞。
　　 除了種子細胞外，尋找一種適合脂肪組織工程的支架材料也是一項挑戰(zhàn)。細胞外

3、基質(extracellular matrix，ECM)是由生物大分子構成的錯綜復雜的網(wǎng)絡。在體內為細胞的生存及活動提供適宜的環(huán)境，并通過與細胞黏附分子、調節(jié)因子和連接蛋白等一系列與細胞生存、發(fā)育和代謝相關的細胞因子的相互作用，影響細胞的形狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化。ECM支架材料的種屬差異小，抗原性較弱，移植后不易產(chǎn)生排斥反應。將脫細胞ECM移植于組織缺損區(qū)后，可為細胞提供適宜其生存的三維空間和促進移植物新生血管化的建立，有利于

4、細胞獲得足夠的營養(yǎng)物質，進行氣體交換并排除廢物，并且可作為自體細胞生長框架，誘導自體細胞長入其內。ECM支架的組織來源有：小腸粘膜下基質、血管、皮膚、神經(jīng)、骨骼肌和膀胱等。而研究較多的是豬小腸來源的小腸粘膜下層(smallintestinal submucosa，SIS)。SIS是天然細胞外基質類生物衍生材料，主要成分為Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維，還含有多種生長因子，如FGF-2、TGF-β和VEGF等。SIS免疫原性低，有抗微生物活性，有良好的

5、細胞相容性，可促進多種細胞在材料上的黏附、生長和分化。SIS植入宿主體內后，能迅速誘導細胞浸潤，刺激血管生成和宿主細胞的長入與分化，由此產(chǎn)生的再生組織在結構和功能上均與原位組織相似。目前，SIS主要用于血管、肌腱、韌帶、骨膜和膀胱等組織的修復。
　　 作為組織工程的支架材料，ECM具有良好的生物相容性和可降解性，但目前該支架材料主要來源是動物或人尸體，這就容易產(chǎn)生免疫原性問題和病原菌傳播的危險。脂肪組織是遍布人體的一種結締組織，

6、具有能量儲存、緩沖作用、絕緣作用等獨特的功能。脂肪組織主要由充滿脂滴的脂肪細胞組成，還有其它的細胞成分包括：成纖維細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、血細胞和脂肪源性干細胞。除此以外，在脂肪組織中還有重要的ECM成分，如膠原、網(wǎng)狀纖維、彈性纖維、神經(jīng)纖維、血管基質和淋巴結等物質，以及含有內分泌功能的細胞因子。最近有研究證實將脂肪組織通過不同的脫細胞方法制備成的三維支架，不僅保留了大部分細胞外基質成分，而且可以促進ASCs的粘附、增殖和成脂分化。

7、既ECM構建了一種有利于干細胞活化的微環(huán)境，以保證干細胞的再生功能。由于脂肪組織具有來源豐富，只需通過吸脂術等簡單的手術即可獲得，安全性高，更重要的是不存在免疫排斥反應和倫理學問題。
　　 本實驗分別用豬小腸和人脂肪抽吸術后的脂肪組織，制備兩種不同來源的ECM支架，制備成粉末狀，分別構建SIS和AT-ECM微粒支架。觀察兩種材料的脫細胞潔凈度和形態(tài)結構。從脂肪抽吸術后的脂肪組織中提取分離脂肪源性干細胞，經(jīng)體外擴增培養(yǎng)后，從細胞生

8、長動力學、形態(tài)學、增殖分化能力和表面標記物等諸多方面探究其生物學特性。將人的ASCs與兩種微粒支架材料體外復合后，觀察種子細胞在兩種材料上的粘附和生長情況。并將與細胞復合后的SIS和AT-ECM微粒支架注射到裸鼠體內，比較兩種材料對ASCs粘附、增殖和成脂分化能力的影響。以期為再生醫(yī)學和組織工程器官替代物，尤其是脂肪組織工程器官生物產(chǎn)品提供一種功能更有效使用更方便的器官移植的人工支架材料。
　　 一、材料
　　 材料與方

9、法
　　 (一)組織材料
　　 人脂肪組織來自8例行腹部脂肪抽吸術的健康成年女性患者，年齡24-47歲，平均35.13±7.62歲，無傳染病和內分泌疾病。
　　 (二)實驗動物
　　 裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術中心，豬小腸空腸段來自沈陽市肉聯(lián)加工廠
　　 (三)實驗材料
　　 低糖DMEM、胎牛血清(Gibco)，Ⅰ型膠原酶、異丁基甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素、吲哚美辛、β-甘油磷酸

10、鈉、油紅O(Sigma)，CD31-FITC、CD45-FITC、CD34-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD49d-PE、CD106-PE單克隆抗體(eBioscience)，細胞周期檢測試劑盒(凱基生物)，Real time PCR試劑盒(TaKaRa)。
　　 二、方法
　　 (一)人脂肪源性干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 將吸脂術后脂肪組織用膠原酶消化法，分離培養(yǎng)脂肪源性干細胞。相差顯微鏡觀察細胞

11、形態(tài)，MTT法測定P3、P9、P15、P20代的細胞生長活性；流式細胞儀測定細胞周期和表面抗原表達；成脂成骨誘導后分別行油紅O和茜素紅染色定性。
　　 (二)兩種細胞外基質微粒支架(SIS，AT-ECM)的制備特性及體外相容性觀察
　　 取豬小腸的空腸段，用物理方法和化學方法制備SIS，取吸脂術后的脂肪組織用酶消化法和機械方法制備AT-ECM，組織學染色和掃描電鏡觀察其結構及脫細胞情況；將兩種材料制備成粉術狀后與ASCs

12、進行復合，用MTT和掃描電鏡方法觀察兩種微粒支架與種子細胞的相容性。
　　 (三)兩種細胞外基質微粒支架(SIS，AT-ECM)體內成脂分化觀察和比較
　　 將脂肪源性干細胞與SIS、AT-ECM微粒支架材料體外復合，注射入裸鼠背部皮下，以不與基質微粒支架材料復合的單純ASCs植入做為對照，分別于注射后4周和8周時取出，行HE染色、油紅O染色和Real time PCR技術檢測細胞在兩種材料中的成脂分化結果，并進行比較。

13、
　　 結果
　　 一、人脂肪源性干細胞的生物學特性
　　 人脂肪源性干細胞在形態(tài)上類似成纖維細胞，呈漩渦狀生長；MTT檢測結果顯示分離培養(yǎng)的ASCs傳至15代仍有較強的增殖活性，之后逐漸減慢，至20代時細胞增殖速度明顯降低；細胞周期分析發(fā)現(xiàn)ASCs具有干細胞的特性；流式細胞儀檢測結果顯示間充質干細胞標記CD90、CD44表達陽性，造血干細胞標記CD34、血細胞標記CD45、內皮細胞標記CD31表達均為陰性，另外

14、，CD49d低表達，CD106表達陰性；成脂誘導后細胞內可見大量脂滴形成，油紅O染色陽性；成骨誘導后鏡下可見鈣結節(jié)形成，茜素紅染色陽性。
　　 二、SIS和AT-ECM微粒支架的結構和體外相容性結果
　　 兩種材料凍干粉碎后呈粉末狀，HE染色未見藍染的細胞核及殘留的細胞或細胞碎片。Masson染色顯示脫細胞后的主要成分為膠原纖維，還有少量的肌纖維。掃描電鏡觀察兩種支架材料主要由膠原纖維構成的網(wǎng)狀結構，SIS網(wǎng)格狀結構更為

15、完整；ASCs與兩種材料的體外復合實驗說明SIS和AT-ECM微粒支架都能促進種子細胞的粘附和生長，但后者作用更明顯。
　　 三、ASCs在兩種微粒支架上的體內成脂分化結果
　　 兩種不同的支架材料體內植入4周和8周取材，各組都有肉眼可見的新生組織形成，大體觀察呈黃色，柔軟，接近人體脂肪組織，新生組織濕重統(tǒng)計分析各組間無顯著性差異(P>0.05)。HE染色可見脂肪細胞形成，胞內有較大脂滴，細胞核偏于一側，細胞間可見疏松結

16、締組織分隔。但是只有AT-ECM組發(fā)現(xiàn)其具有血管成分，油紅O染色陽性，8周時較為明顯。SIS組油紅O染色弱陽性，而ASCs組則為陰性。Real time PCR檢測結果顯示AT-ECM組中成脂分化相關基因PPARγ2、LPL和Leptin呈高表達，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結論
　　 人脂肪抽吸物經(jīng)酶消化法能分離出具有成纖維細胞形態(tài)的干細胞，在體外培養(yǎng)條件下能保持穩(wěn)定的增殖，表達脂肪間充質干細胞相關的表面抗原

17、，在誘導因子的作用下能向脂肪細胞和成骨細胞分化。
　　 應用物理和化學方法能成功的對豬空腸進行脫細胞處理，制備SIS微粒支架，它是一種主要由膠原纖維組成的三維網(wǎng)狀結構。應用機械方法和酶消化方法對人脂肪組織進行脫細胞處理有效，制備成功的AT-ECM微粒支架在形態(tài)學上與SIS相似，也是由膠原纖維組成的網(wǎng)狀結構。與ASCs復合培養(yǎng)結果表明：AT-ECM和SIS都能促進細胞的粘附增殖，前者的作用更明顯。
　　 裸鼠體內實驗結果顯