Cks1、Cks2對人類肝癌細胞系HepG2增殖與凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　研究CKs1、CKs2對肝癌細胞HepG2增殖、凋亡及細胞周期調(diào)控的影響，探究肝細胞癌致病機理，為肝細胞癌臨床治療提供新的線索。
　　方法：
　　1、設(shè)計并合成分別針對Cks1、Cks2基因的SiRNA序列，以脂質(zhì)體介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染肝癌細胞株HepG2，干擾目的基因的表達；
　　2、構(gòu)建分別針對Cks1、Cks2基因的pcDNA3.1/Hygro-IRES2-EGFP質(zhì)粒載體，使用脂質(zhì)體介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染肝癌細胞株

2、HepG2，增強目的基因的表達，建立過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系；
　　3、轉(zhuǎn)染后收集細胞，應(yīng)用real-time PCR分別檢測Cks1、Cks2mRNA表達水平。應(yīng)用western blot分別檢測Cks1、Cks2蛋白質(zhì)表達情況。
　　4、運用CCK-8和細胞計數(shù)方法檢測干擾和增強后細胞的增殖情況；
　　5、應(yīng)用Annexin-V/PI雙染細胞，以順鉑誘導(dǎo)細胞凋亡，流式細胞術(shù)分析干擾和增強后細胞凋亡情況。
　　6、

3、使用PI染色，流式細胞術(shù)分析干擾和增強后細胞周期變化。
　　7、選取若干個與細胞生存、增殖密切相關(guān)的蛋白質(zhì)——Akt、GSK-3β、Bcl-2，在目的基因干擾后進行western blot檢測，觀察蛋白表達的變化。
　　結(jié)果：
　　1、RNA干擾后24-96小時，Cks1、Cks2 mRNA和蛋白表達水平明顯下降，蛋白水平以轉(zhuǎn)染后48小時干擾效果最佳。
　　2、篩選出Cks1、Cks2過表達穩(wěn)定細胞系。
　

4、　3、CCK-8和細胞計數(shù)檢測顯示：干擾細胞內(nèi)源性Cks蛋白之后，HepG2細胞的增殖速度減慢；而過表達Cks蛋白能夠促進細胞增殖。
　　4、細胞凋亡流式檢測結(jié)果顯示：HepG2細胞的凋亡率隨著 Cks蛋白表達的下調(diào)而增高；Cks蛋白表達水平的升高，使細胞凋亡率減少。
　　5、周期實驗分析表明：過表達Cks1，能夠促進HepG2細胞由G0/G1期進入S期。
　　6、Akt、GSK-3β蛋白的磷酸化部分pAkt、pGSK