人SLC真核表達載體的構建，表達及其效應研究.pdf

1、次級淋巴樣組織趨化因子(secondary lymphoid tissue chemokine，SLC)最早發(fā)現是一種T細胞特異性趨化因子，對NK細胞和成熟的DC也具有一定的趨化作用。T、NK細胞和DC在機體抗腫瘤免疫中重要的作用。研究表明，缺乏鼠SLC的小鼠T細胞歸巢和DC定位發(fā)生障礙，次級淋巴組織結構功能紊亂。近期研究發(fā)現，SLC受體CCR7表達于初始T細胞、B細胞、DC細胞及黑色素瘤細胞，乳腺癌細胞等多種惡性腫瘤細胞表面，淋

2、巴結部位SLC與其受體CCR7的結合，可促使細胞向淋巴結等次極細胞組織移動，與淋巴細胞歸巢有關。因此，SLC及其受體極富潛力成為自身免疫性疾病、移植排斥反應及腫瘤藥物設計的新型靶點。本課題組前期研究發(fā)現，一定濃度梯度的標準SLC蛋白能夠抑制腫瘤生長，并且能夠促進外周血淋巴細胞有一定程度的增殖。 目的：本實驗采用基因工程技術，構建人SLC真核表達載體，轉染MCF-7細胞，檢測SLC在細胞中的表達，隨后檢測其對轉染細胞的作用及對PB

3、MC的影響，為進一步研究SLC的作用機制及相關疾病應用研究奠定基礎。 方法： 1．人SLC真核表達載體的構建與表達 （1）人SLC基因表達載體的構建及測序 以本室已有SLC-RFP為模板，體外PCR擴增基因SLC片斷，質粒pgenesil-8、SLC回收產物雙酶切后，回收片斷進行連接，獲得質粒pgenesil-8-SLC，經酶切鑒定及測序分析證實，所克隆和構建的SLC cDNA閱讀框及連接部位序列正確；

4、 （2）人SLC真核表達載體轉染MCF-7及其表達 質粒轉染乳腺癌細胞MCF-7，24小時后通過倒置熒光顯微鏡可觀察到細胞內有綠色熒光表達；western blot檢測轉染細胞24-72小時的培養(yǎng)上清。結果表明，SLC-GFP以分泌型形式表達，并在轉染后72小時達到高峰； 2．轉染SLC對MCF-7細胞凋亡的影響 實驗分組 1）空白組：MCF-7 2）轉染空載pgenesil8-GFP的

5、MCF-7對照組：MCF-7-vector 3）轉染SLC的MCF-7實驗組：MCF-7-SLC 采用流式細胞術檢測轉染的SLC對腫瘤細胞凋亡作用，結果表明轉染SLC的MCF-7細胞與未轉染SLC及轉染空載的MCF-7相比，能顯著促進轉染細胞的凋亡。 3．轉染SLC的MCF-7對PBMC增殖作用 實驗分組 1）空白對照組：PBMC以培養(yǎng)基刺激 2）MCF-7刺激組：未轉染質粒的MCF-7刺

6、激PBMC 3）MCF-7-vector：轉染空載體的MCF-7刺激PBMC 4）MCF-7-SLC：轉染SLC的MCF-7刺激PBMC 以正常人外周血單個核細胞（PBMC）為反應細胞，以經絲裂霉素C處理的MCF-7、轉染空載體的MCF-7及轉染SLC的MCF-7作為刺激細胞，不同的刺激細胞分別與PBMC以1:5比例混合培養(yǎng)5天后流式細胞儀檢測，結果表明MCF-7-SLC能促進PBMC的增殖。 結論：成功