抗氧化低密度脂蛋白抗體在動(dòng)脈粥樣硬化中的臨床及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)發(fā)病機(jī)理的研究，有越來(lái)越多的證據(jù)表明AS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，炎癥反應(yīng)擔(dān)當(dāng)著重要的作用，它貫穿疾病發(fā)生的始終。其中單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞也是人體主要的免疫細(xì)胞，因此免疫和炎癥必然密不可分，免疫機(jī)制在AS中的相關(guān)研究業(yè)因此成為了AS研究中的新熱點(diǎn)。研究表明自身免疫在AS的病理過(guò)程中發(fā)揮著極為重要的作用，包括熱休克蛋白、C-反應(yīng)蛋白及眾多的修飾后脂蛋

2、白都可以誘發(fā)自身抗體的生成。 氧化低密度脂蛋白(Oxidizedlowdensitylipoprotein，OX-LDL)最初因?yàn)槠漭^低密度脂蛋白(Lowdensitylipoprotein，LDL)有更強(qiáng)的致泡沫細(xì)胞作用及細(xì)胞毒性，成為AS研究的熱點(diǎn)。后繼的研究發(fā)現(xiàn)，LDL在氧化過(guò)程中伴隨著一系列的脂質(zhì)及蛋白的分解和重新組合過(guò)程，產(chǎn)生了新的表位，具有類似異體蛋白的免疫源性，能夠誘發(fā)自身抗體。已有的臨床及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)抗OX-LD

3、L抗體和AS的關(guān)系密切，但是其在AS中的具體機(jī)制仍然不清楚。 該研究從臨床、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞研究三方面對(duì)抗氧化低密度脂蛋白抗體在AS發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮的作用機(jī)制進(jìn)行了探討： 1.觀察臨床冠心病患者外周血抗OX-LDL水平與其臨床表現(xiàn)的關(guān)系，探討自身抗體在臨床工作中的實(shí)踐意義； 2.通過(guò)AS實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，觀察斑塊病變內(nèi)免疫復(fù)合物的出現(xiàn)時(shí)間和局部分布特征，并給予辛伐他汀干預(yù)后觀察其對(duì)免疫復(fù)合物影響。希望以此來(lái)進(jìn)一步探討

4、免疫復(fù)合物與AS形成的關(guān)系及辛伐他汀可能存在的免疫調(diào)節(jié)作用； 3.通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察抗OX-LDL抗體干預(yù)對(duì)OX-LDL與單核細(xì)胞相互作用的影響，探討免疫復(fù)合物參與泡沫細(xì)胞形成的可能機(jī)制。 方法 1.以2002年12月—2003年6月住院治療的冠心病患者共38例為觀察對(duì)象，依據(jù)臨床表現(xiàn)將其分為穩(wěn)定性心絞痛(Stableanginapectoris，SAP)、不穩(wěn)定性心絞痛(Unstableanginapect

5、oris，UAP)、急性心肌梗死(Acutemyocardiuminfarction，AMI)3組，另有13例無(wú)冠心病及主要危險(xiǎn)因子的患者作為對(duì)照組(Controlgroup，CON)，留取其血漿標(biāo)本，以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法(Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)測(cè)定外周血抗OX-LDL抗體(IgG)水平。利用冠狀動(dòng)脈造影技術(shù)(CoronaryAngiography，CAG)，對(duì)患者的冠脈狹窄程度進(jìn)行

6、半定量測(cè)定。其他資料，通過(guò)臨床工作及常規(guī)生化檢查獲得。 2.將34只純種新西蘭大白兔分為對(duì)照組，高脂組，辛伐他汀預(yù)防組及辛伐他汀治療組，分兩階段造模：半數(shù)的對(duì)照組、高脂組以及辛伐他汀預(yù)防組在8周；另一半的對(duì)照組、高脂組及辛伐他汀治療組在第14周處死，取其主動(dòng)脈標(biāo)本，利用HE染色分析血管結(jié)構(gòu)改變及斑塊的生成發(fā)展情況。免疫組織化學(xué)技術(shù)分析AS斑塊病變內(nèi)免疫復(fù)合物的沉積及其類型以及辛伐他汀干預(yù)對(duì)免疫復(fù)合物形成的影響。 3.U9

7、37細(xì)胞和新西蘭大白兔外周血單核細(xì)胞，經(jīng)OX-LDL(人，10mg/L)及抗OX-LDL抗體(兔抗人，5mg/L)2個(gè)因素組合共分為對(duì)照組、OX-LDL刺激組、OX-LDL+抗OX-LDL抗體共孵育組及單純抗OX-LDL抗體組4組，共培養(yǎng)24小時(shí)后，利用半定量RT-PCR技術(shù)分析CD36、CD40、MMP-9的mRNA表達(dá)量。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：隨機(jī)多組間均數(shù)比較用單向方差分析法，組間多重比較比較用SNK-q法，隨機(jī)多組計(jì)數(shù)資料率

8、及比值比較用卡方檢驗(yàn)。資料間相關(guān)分析用線性相關(guān)，顯著性用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料用Spearman相關(guān)分析，顯著性檢驗(yàn)用非參數(shù)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)p值統(tǒng)一為0.05。 結(jié)果 1.冠心病患者抗OX-LDL抗體水平顯著高于對(duì)照組，其中又以ACS患者為顯著，ACS患者外周血中的抗OX-LDL抗體又具有延遲效應(yīng)，觀察期內(nèi)入院后7-10天的水平最高，各組之間的差異也最明顯：AMI組(42.33±34.71)、UAP(47.45±20.56)、

9、SAP組(34.61±40.88)。冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果的半定量分析提示，冠心病患者各組之間無(wú)顯著性差異：AMI組(1.0716±0.8957)、UAP組(1.0311±0.5971)、SAP組(0.9555±0.0133)、CON組(0.9158±0.0278)?？筄X-LDL抗體水平和血漿LDL濃度及冠脈狹窄程度之間沒(méi)有顯著相關(guān)性。在冠心病相關(guān)的各個(gè)因子中，體重指數(shù)(p=0.000)、平均吸煙量(p=0.007)、血壓水平(p=0.00

10、0)、空腹血糖水平(p=0.04)及高密度脂蛋白(High-densitylipoprotein，HDL，p=0.08)在各組之間有顯著性差異。 2.動(dòng)物模型的主動(dòng)脈在高脂喂養(yǎng)8周后即形成明顯的AS斑塊，高脂組的相對(duì)斑塊面積是辛伐他汀預(yù)防組的約9.44倍。而到了第14周時(shí)高脂組的相對(duì)斑塊面積進(jìn)一步增加到8周時(shí)的2.93倍，是辛伐他汀治療組的6.33倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，IgG型免疫復(fù)合物在粥樣斑塊內(nèi)的形

11、成明顯增多，而IgM型免疫復(fù)合物在斑塊病變中的沉積不明顯。同期的高脂組免疫組化染色強(qiáng)陽(yáng)性率都顯著高于辛伐他汀干預(yù)組。IgG型免疫復(fù)合物在早期斑塊分布于內(nèi)膜下，而在成熟斑塊則主要分布于脂質(zhì)核心和靠近內(nèi)膜面肩部。 3.在加入抗OX-LDL抗體后可，OX-LDL刺激后的單核/巨噬細(xì)胞CD36、CD40、MMP9等因子的mRNA表達(dá)均有不同程度的減少，其中CD36和MMP9在U937細(xì)胞和在兔單核細(xì)胞分別平均降低了約64.80％和35.

12、18％，細(xì)胞種屬間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在U937細(xì)胞和在兔單核細(xì)胞分別平均降低了約47.21％和36.72％，種屬間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1.抗OX-LDL抗體水平和動(dòng)脈粥樣硬化臨床事件有正性關(guān)系，提示了自身免疫在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定的抗OX-LDL抗體可能成為評(píng)估AS危險(xiǎn)的一個(gè)重要指標(biāo)?？筄X-LDL抗體水平和冠脈狹窄程度及外周血LDL濃度缺乏相關(guān)性，其可能是AS一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的因子

13、。在國(guó)人的AS患者中，HDL濃度的變化較LDL濃度的變化可能更有意義。 2.動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)存在著免疫復(fù)合物，以IgG型為主，其出現(xiàn)時(shí)間和分布情況均提示它和AS的形成和發(fā)展密切相關(guān)。IgM型免疫復(fù)合物在斑塊內(nèi)少量存在，其作用不甚清楚，可能和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。辛伐他汀可以在顯著降低血脂和控制斑塊發(fā)展的同時(shí)可以有效的減少斑塊內(nèi)免疫復(fù)合物的生成，可能和其具有的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。 3抗OX-LDL抗體在離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中可以抑制單核細(xì)