HGF-c-Met在血管損傷修復中促進內(nèi)皮祖細胞增殖機制及歸巢作用的研究.pdf

1、1.背景與目的:
　　 血管內(nèi)皮受損是粥樣硬化斑塊形成的始動因素,也是血管損傷后不良修復反應的主要原因之一。長期以來,傳統(tǒng)觀念認為血管內(nèi)膜損傷后內(nèi)皮修復只有依靠損傷血管內(nèi)膜邊緣的內(nèi)皮細胞(endothelial cell,EC)參與再生。近年來,實踐證明鄰近參與再生的Ecs喪失再生能力或修復的范圍有限,雖其遠端細胞具有復制能力,但鄰近局部內(nèi)皮增生、遷移形成的再生內(nèi)皮還會存在表型改變、功能不足或紊亂而不能發(fā)揮正常內(nèi)皮功能,也難到達

2、損傷位置而不能完成損傷血管內(nèi)膜的修復。
　　 細胞移植治療近年來已成為治療多種疾病的新策略,其目的是替代、修復或加強受損組織或器官的生物學功能。循環(huán)、骨髓及脾臟來源的內(nèi)皮祖細胞(endothelialprogenitor cell,EPC)被認為在血管損傷后的內(nèi)皮修復中起到了越來越重要的作用。并且,研究發(fā)現(xiàn)EPCs易于在體外被基因修飾后再進行移植,這使得EPCs成為血管損傷后一種理想的治療手段。但是,盡管目前研究證實機體自身動員

3、的EPCs能夠參與內(nèi)皮功能不全及血管損傷的修復,但并不能完全修復損傷血管并阻止過度新生內(nèi)膜形成及血管不良重構(gòu)的發(fā)生。其認為一方面是機體自身動員不足、自身來源的EPCs具有不同程度的功能不全;另一方面是循環(huán)中EPCs不能充分的優(yōu)勢分布并粘附至血管靶部位。因此深入了解EPCs的調(diào)節(jié)機制,找到促進移植的EPCs向損傷血管優(yōu)勢分布的措施將會很大程度的提高修復血管損傷的療效。
　　 EPCs的功能能夠被許多生長因子調(diào)節(jié),其中包括血管內(nèi)皮細

4、胞生長因子(vascularendothelial cell growth factor,VEGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、成纖維細胞生長因子(firoblast growth factor,FGF)、雌激素(estrogen,ESG)等。新近,HGF對EPCs的調(diào)節(jié)逐漸引起重視。HGF被發(fā)現(xiàn)能夠促進人類CD34+造血干細胞的增殖與生存,在肺部受到損傷后能夠從骨髓動員EPCs至受損傷

5、的局部。在高血壓、急性心肌梗塞、糖尿病并發(fā)嚴重并發(fā)癥、外周血管阻塞性疾病和動脈粥樣硬化的病人血清中,HGF的濃度是升高的。并且,有許多證據(jù)表明,在血管損傷局部有HGF的表達,對促進局部內(nèi)皮修復有重要的作用。
　　 HGF促進細胞增殖主要是通過與其特異性的由原癌基因編碼的受體c-Met相結(jié)合后開始的。HGF與其受體結(jié)合后,磷脂酶C-γ(phosphatidase c-γ,PLC-γ)被磷酸化,磷酸化的PLC-γ引起了三磷酸肌醇(i

6、nositol triphosphate,IP3)介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endocytoplasmic reticulum,ER)鈣庫耗竭和接下來的細胞外鈣離子通過細胞膜的內(nèi)流。ER鈣庫耗竭引起的細胞膜鈣離子內(nèi)流通道被稱為鈣庫操作性鈣通道(store-operatedCa2+ channels,SOCCs)。在許多非興奮性細胞,SOCCs被認為是廣泛存在的調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流的機制。Ca2+在細胞內(nèi)充當?shù)诙攀沟淖饔?參與細胞增殖、生存、分化、運動等

7、多種功能。SOCCs的激活依賴于鈣池的耗竭,因此ER必須把鈣庫耗竭的信息傳遞給細胞膜上的鈣通道。一種名為間質(zhì)交感分子1(stromal interaction molecule1,STIM1)的跨膜蛋白被認為是激活SOCCs的重要分子。STIM1被認為是ER上鈣庫容量的感受器,細胞在靜息狀態(tài)時分布于ER膜表面,鈣離子的耗竭導致了STIM1構(gòu)象迅速發(fā)生改變并聚集到細胞膜附近。這種重新分布被認為起到了信號傳遞作用,將ER上鈣離子耗竭的信號傳

8、遞給了細胞膜上的鈣離子通道,導致鈣離子通道的開放。在HGF對EPCs的增殖調(diào)控中,STIM1及SOCCs是否參與其中,調(diào)控機制如何,目前國內(nèi)外均無深入研究。
　　 另外,國外及我們的研究證實靜脈輸注的EPCs能夠優(yōu)勢分布至血管損傷部位參與損傷血管修復,但移植的EPCs定向優(yōu)勢分布的機制仍不清楚。一般認為,損傷局部的微環(huán)境和移植干細胞之間的相互作用促使移植的干細胞向損傷血管定向優(yōu)勢分布。損傷局部上調(diào)表達的炎性因子可能起到一定作用。

9、除炎性因子外,其他一些相對特異的因子如基質(zhì)細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor1,SDF-1)也發(fā)揮一定作用。近來研究發(fā)現(xiàn),HGF也能介導細胞優(yōu)勢分布,在血管損傷局部存在HGF表達。因此,我們有理由推測HGF/c-Met能夠通過趨化作用介導EPCs的優(yōu)勢分布,且局部的HGF能夠促進移植的EPCs存活,提高細胞移植的效果。
　　 本課題通過:1、用RNA干擾STIM1的方法,研究了STIM1在HG

10、F誘導的EPCs增殖效應中的作用。2、構(gòu)建c-Met的腺病毒表達載體,轉(zhuǎn)染至EPCs,使之高表達c-Met,通過靜脈將之輸注大鼠體內(nèi)。利用血管損傷部位含有HGF的特點,以期達到其促進EPCs在移植體內(nèi)存活并通過HGF/c-Met介導其向血管損傷部位優(yōu)勢分布的目的。從而為豐富干細胞研究的理論、進一步認識血管損傷修復機制及探索修復血管損傷的有效方法提供幫助。
　　 2.方法:
　　 2.1 EPCs的分離、培養(yǎng)、鑒定

11、　　 密度梯度離心法獲取大鼠骨髓及脾臟單個核細胞,在添加VEGF的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng),顯微鏡下觀察細胞生長、形態(tài)學變化;UEA-I結(jié)合和DiI-LDL攝取實驗觀察EPCs是否具有內(nèi)皮細胞功能特性;CD34、CD133、VEGFR-2流式鑒定是否具有內(nèi)皮祖細胞表型。
　　 2.2觀察HGF對EPCs增殖功能的影響
　　 胰酶消化EPCs后,接種至96孔板(1×105 cells/mL),EPCs經(jīng)無血清培養(yǎng)同步化后

12、,用四唑鹽比色法(MTT)測定EPCs增殖變化。
　　 2.3 RNA提取與半定量及實時定量PCR
　　 用Trlzol試劑盒提取總RNA,根據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑合說明反轉(zhuǎn)錄CDNA。ABI PRISM7000軟件及熒光染料PCR法行定量PCR檢測。
　　 2.4 Westernblot檢測STIM1蛋白表達。
　　 2.5激光共聚焦檢測內(nèi)皮祖細胞細胞內(nèi)鈣離子熒光強度變化。2.6 STIM1的RNA干擾

13、載體由本實驗室郭瑞威博士提供。2.7重組腺病毒Ad-c-Met的構(gòu)建
　　 從美國ATCC購得目的基因c-Met片段,由北京寶賽生物公司通過同源重組系統(tǒng)構(gòu)建c-Met的病毒過表達載體。
　　 2.8觀察c-Met在血管損傷修復過程中的作用用1-2月齡的SD大鼠復制頸動脈球囊損傷模型,然后從尾靜脈注入轉(zhuǎn)染了c-Met的EPCs。觀察過表達c-Met對損傷后第10天血管再內(nèi)皮化以及第21天新生內(nèi)膜增厚的影響。
　　

14、3.結(jié)果:
　　 3.1 EPCs分離、培養(yǎng)、鑒定:相差顯微鏡下可見分離后單個核細胞呈圓形懸浮于培養(yǎng)基中,胞體透亮,折光性好;細胞培養(yǎng)5d,可以觀察到細胞增多增大并伸展呈橢圓形、短梭型細胞,有少量細胞突起,集落形成較多表明細胞增殖旺盛,有時可見到內(nèi)皮祖細胞首尾相連,呈線狀排列;培養(yǎng)7-10d,長梭型細胞較前明顯增多,并呈簇狀生長,有一定方向性,形成細胞團,簇狀細胞中央細胞呈圓形,外周呈放射狀;培養(yǎng)14d,有些培養(yǎng)瓶中可看到細胞首

15、尾相連,具有成網(wǎng)狀血管樣趨勢生長;繼續(xù)培養(yǎng)至21d,細胞相互融合呈鋪路石狀,用acLDL-Dil和FITC-UEA-1對細胞染色后,通過熒光倒置顯微鏡鑒定,FITC-UEA-1結(jié)合陽性細胞呈現(xiàn)綠色熒光,acLDL-Dil攝取陽性細胞呈現(xiàn)紅色熒光,UEA-1和DiLDL雙染色陽性細胞呈現(xiàn)黃色熒光,這些雙染的細胞被認為是正在分化的EPCs。利用細胞流式分析技術(shù)(FACS)分別檢測CD133、CD34、VEFGR-2在分離培養(yǎng)7d左右細胞表面

16、的表達,我們觀察到CD133、CD34及VEGFR-2在培養(yǎng)細胞中的陽性率分別為85.28％、70.49％和96.68％。
　　 3.2 HGF對EPCs增殖能力的影響
　　 3.3:HGF刺激EPCs引起了經(jīng)SOCCs的鈣離子內(nèi)流增加
　　 3.4 SOCE對HGF誘導的EPC增殖能力的影響。
　　 3.5 HGF作用于:EPCs引起了STIM1表達的上調(diào)。
　　 3.6 RNA干擾后STIM1

17、表達后抑制了SOCE及HGF誘導的EPCs的增殖效應用STIM1的腺病毒干擾載體,干擾STIM1的蛋白表達。
　　 3.7 過表達c-Met對球囊損傷后血管再內(nèi)皮化的影響
　　 3.8 過表達c-Met對球囊損傷后血管內(nèi)膜增生的影響
　　 4.結(jié)論:
　　 1)、HGF促進EPCs的增殖;
　　 2)、HGF刺激EPCs引起了經(jīng)SOCCs的鈣離子內(nèi)流增加;
　　 3)、SOCCs阻斷劑明顯