B16F10-ESAT-6-gpi-IL-21腫瘤干細胞疫苗的制備及其抗腫瘤效應的研究.pdf

1、惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)簡稱惡黑，是一種惡性程度極高的皮膚腫瘤，多發(fā)生于皮膚體表，占皮膚惡性腫瘤的7％～20％，可轉移至肺和腦等部位。近年來惡黑發(fā)病率，死亡率呈不斷上升趨勢，發(fā)病年齡也愈來愈早，且極易擴散，復發(fā)率高，受到人們重視。目前，針對惡黑的治療手段包括手術、放療、化療、免疫治療等，但是由于部分黑色素瘤細胞對放療、化療的抵抗，造成黑色素瘤的復發(fā)，成為徹底清除腫瘤的最大障礙。因此尋找新的治療途徑已成為

2、提高惡黑患者生存率的關鍵。
　　以免疫治療為主的生物治療已經(jīng)發(fā)展成為腫瘤治療的新模式。免疫治療一般包括:細胞因子治療、過繼性免疫治療、腫瘤疫苗、抗體為基礎的免疫治療、分子靶向治療等。其中腫瘤的治療性疫苗，尤其是腫瘤細胞疫苗、基因工程疫苗等都取得了可喜的進展。疫苗能夠激活機體的自然殺傷細胞(NK)和特異性細胞毒性T細胞(CTL)，產(chǎn)生抗腫瘤的保護性免疫應答作用，有著廣闊的應用前景。但由于腫瘤抗原免疫原性弱、腫瘤免疫逃逸機制復雜、腫瘤

3、的異質性等原因，疫苗的實際療效與預期有很大差距，如何提高腫瘤疫苗免疫原性，激發(fā)宿主免疫系統(tǒng)對瘤細胞免疫攻擊效應已成為研究內容之一。
　　以整個腫瘤細胞作為抗原來源是腫瘤疫苗發(fā)展趨勢之一，具有不需鑒定其腫瘤特異性抗原的優(yōu)點，但其免疫原性弱、特異性差，因此需要人為的改變其免疫原性或以細胞因子為佐劑，改變接種部位微環(huán)境，激活抗原提呈細胞(APC)，增強免疫反應。本課題組前期的部分實驗結果提示:向小鼠黑色素瘤B16F10細胞導入糖基化磷脂

4、酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)修飾的6kD結核桿菌早期分泌靶抗原(6kD earlysecretary antigenic target，ESAT-6)和白細胞介素-21(IL-21)基因制成的瘤苗，膜表達強免疫原性的“異種抗原”ESAT-6，打破機體的免疫耐受，誘導產(chǎn)生腫瘤特異性的免疫應答，而分泌表達的IL-21作為免疫佐劑可增強荷瘤鼠NK、CTL抗腫瘤活性，兩者分別以不同機制發(fā)揮誘導抗

5、腫瘤免疫應答，但這種效應對腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)作用如何仍有待研究。
　　CSCs是腫瘤中具有干細胞特性的一類細胞，既具備高度增殖能力與自我更新能力，也具備多向分化潛能的細胞，這部分細胞雖只占少部分，但卻是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關鍵細胞，對惡性腫瘤的治愈有著深遠的意義。CSCs做為抗腫瘤研究的靶細胞，近幾年來對其研究在不斷深入，如用CSCs聯(lián)合樹突狀細胞(DC)免疫小鼠后，能拮抗野生型腫瘤細胞的攻擊，

6、表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤效果。
　　本研究選擇小鼠黑色素瘤細胞系B16F10細胞，將構建好的pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21通過脂質體轉染B16F10細胞并篩選穩(wěn)定轉染株。然后從中分選出B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+ CSCs免疫C57BL6小鼠，研究其免疫效應與拮抗腫瘤效應。
　　目的:
　　探討表達ESAT-6-gpi和IL-21的黑色素瘤B16F10 CD133+CD

7、44+ CSCs瘤苗抗腫瘤效應，為以CSCs瘤苗治療黑色素瘤提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.將構建好的重組質粒pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21通過脂質體轉染B16F10細胞，并通過G418篩選穩(wěn)定轉染的細胞株。用免疫熒光和Western blot分別檢測穩(wěn)定轉染細胞株ESAT-6和gpi/IL-21在細胞膜表面的表達。
　　2.將單克隆擴大培養(yǎng)的B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21細胞，利用免

8、疫磁珠分選技術分離出B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+ CSCs，以5×105個經(jīng)絲裂霉素滅活的細胞免疫C57BL/6小鼠，共免疫三次，每次間隔14天，末次免疫后10天，以5×105 B16F10野生型細胞攻擊免疫鼠。同時設B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133-CD44-細胞、B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21細胞和B16F10 CD133+CD44+ CSCs為對照

9、，以上述同樣方法免疫和攻擊小鼠。
　　3.觀察各組小鼠腫瘤生長情況，并通過檢測免疫小鼠血清細胞因子，補體依賴的細胞毒活性(CDC)、脾細胞、NK細胞毒活性以及上皮間質轉化(EMT)相關蛋白表達，比較CSCs瘤苗與普通瘤苗的抗腫瘤效果差異。
　　結果:
　　1.經(jīng)免疫熒光和Western Blot檢測，證實穩(wěn)定轉染的B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21膜表達異種抗原ESAT-6，并且分泌表達IL-21，且瘤苗免

10、疫小鼠血清中檢測到ESAT-6抗體。
　　2.用免疫磁珠分選技術分選出B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+ CSCs細胞，免疫C57BL6小鼠后，B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+ CSCs瘤苗免疫小鼠成瘤率，腫瘤體積，腫瘤生長速度均較普通瘤苗低，差異均有顯著性意義，(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21

11、CD133+CD44+ CSCs瘤苗免疫組小鼠血清IFN-γ水平，CDC、脾細胞及NK細胞毒活性均較普通瘤苗高，差異有明顯的統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。 CSCs瘤苗免疫組小鼠腫瘤組織中EMT相關蛋白即E-鈣黏著蛋白高表達，波形蛋白低表達，差異有顯著性意義，(P＜0.05)。
　　結論:
　　本研究制備出基因修飾的B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+ CSCs瘤苗，能有效的誘導特異性細胞免疫