CXCR4基因合成及其在兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)的初步研究.pdf

1、目的：研究表明SDF-1/CXCR4信號軸在移植細(xì)胞向損傷部位遷移中發(fā)揮重要作用，而干細(xì)胞能夠?qū)ν俗冏甸g盤起修復(fù)作用。本實驗室前期實驗中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人和兔退變的椎間盤組織中存在著SDF-1的濃度表達(dá)梯度，但由于CXCR4在MSCs表面的表達(dá)率比較低，可能影響其向損傷部位遷移。所以本研究旨在合成CXCR4基因，構(gòu)建CXCR4真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染MSCs，提高CXCR4在MSCs的表達(dá)，進(jìn)而為后期利用SDF-1/CXCR4軸的趨化機(jī)制提高M(jìn)SC

2、s的遷移效率并促進(jìn)對退變椎間盤修復(fù)提供實驗基礎(chǔ)。
　　材料和方法：
　　1.根據(jù)GenBank中已發(fā)表的兔CXCR4(Gene ID100346189)編碼區(qū)全長及酶切位點需要，設(shè)計重疊引物，采用OE-PCR的方法合成CXCR4的cDNA。雙酶切將pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體，和CXCR4基因片段連接，構(gòu)建CXCR4-pIRES2-EGFP重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化抽提質(zhì)粒并保存。進(jìn)行雙酶切、PCR及測序鑒定。
　　2.復(fù)蘇

3、前期實驗中凍存的BMSCs，建立體外培養(yǎng)體系。
　　3.脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒及空白質(zhì)粒到BMSCs，觀察細(xì)胞生長情況，熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá)情況。β-actin作為內(nèi)參半定量RT-PCR檢測CXCR4瞬時轉(zhuǎn)染效率。
　　4.在Transwell小室內(nèi)觀察MSCs、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSCs、CXCR4-MSCs對SDF-1的體外趨化遷移情況。
　　5.預(yù)實驗獲取G418篩選濃度，G418篩選MSCs。
　　

4、結(jié)果：
　　1.酶切、測序鑒定均證明CXCR4 cDNA和重組質(zhì)粒CXCR4-pIRES2-EGFP構(gòu)建正確，大量提取的無內(nèi)毒素質(zhì)?？梢杂米鬟M(jìn)一步實驗。
　　2.復(fù)蘇后的MSCs生長形態(tài)、活力曲線及增殖情況均提示細(xì)胞復(fù)蘇成功。
　　3.轉(zhuǎn)染后24小時熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白表達(dá)提示轉(zhuǎn)染成功，半定量RT-PCR提示CXCR4表達(dá)量較空白組增強(qiáng)約21％。
　　4.SDF-1濃度為0時，三組細(xì)胞遷移數(shù)目無明顯差異(

5、p>0.05)；SDF-1濃度為10，100μg/l時，CXCR4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移數(shù)目明顯高于末轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(p<0.01)。
　　5.G418篩選的MSCs大量死亡，存活細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)率于未篩選前無明顯差異(p>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.采用OE-PCR成功合成兔CXCR4 cDNA：
　　2.成功構(gòu)建了攜帶有兔CXCR4基因的CXCR4 pIREs2-EGFP真核表達(dá)載體，并擴(kuò)大提取保