人牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定和體外誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的未分化細(xì)胞，按來(lái)源分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。成體干細(xì)胞因具有來(lái)源廣泛、可塑性強(qiáng)、無(wú)排斥反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一。目前已經(jīng)在機(jī)體幾乎所有組織中發(fā)現(xiàn)了成體干細(xì)胞。這些成體干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)不僅為機(jī)體損傷修復(fù)機(jī)理研究提供了新的研究平臺(tái)，而且將通過(guò)干細(xì)胞移植或構(gòu)建人工組織器官在人類多種疾病治療史上產(chǎn)生劃時(shí)代的影響。 牙周膜干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，2004年由Byoung首次提出，并且證實(shí)了其在

2、一定條件下能形成牙周膜牙骨質(zhì)樣復(fù)合體，這將為其組織工程化研究提供理論依據(jù)和可靠的細(xì)胞來(lái)源。目前對(duì)人牙周膜干細(xì)胞的研究尚處于起始階段，在國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)人牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)成功的報(bào)道。 本研究采用克隆化培養(yǎng)，免疫磁珠法分離純化人牙周膜細(xì)胞，并通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性及免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)分離純化的人牙周膜細(xì)胞進(jìn)行了初步鑒定，并在此基礎(chǔ)上，成功的對(duì)分離出的人牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行了體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，為后期研究牙周膜牙骨質(zhì)復(fù)合體的人工生物器官的構(gòu)建和

3、牙周膜再生治療提供了重要的理論和依據(jù)。 目的 研究牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)特性，為后期研究牙周組織工程的生物器官的構(gòu)建和牙周膜再生治療提供理論基礎(chǔ)。分離純化人牙周膜細(xì)胞，初步了解純化后人牙周膜細(xì)胞特性，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性及免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)分離純化的細(xì)胞進(jìn)行初步鑒定，并在此基礎(chǔ)上，探討其分化的細(xì)胞學(xué)機(jī)理，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其生物學(xué)特性，為后期研究牙周膜牙骨質(zhì)復(fù)合體的人工生物器官的構(gòu)建和牙周膜再生治療提供重要的理論依據(jù)。

4、 方法 1、分離純化人牙周膜細(xì)胞收集臨床因正畸需要拔除的年輕恒牙，刮下其牙周膜組織，運(yùn)用酶消化法獲得牙周膜細(xì)胞，采用克隆化培養(yǎng)，免疫磁珠法分離純化獲得純化后的牙周膜細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 2、純化后的人牙周膜細(xì)胞的初步鑒定運(yùn)用透射電鏡、流式細(xì)胞儀，觀察和研究細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞周期特點(diǎn)，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)純化后牙周膜細(xì)胞表面相對(duì)特異性蛋白的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行初步鑒定。 3、人牙周膜干

5、細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究分別對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行成骨、成神經(jīng)細(xì)胞樣的誘導(dǎo)分化，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞表面相對(duì)特異性蛋白的表達(dá)，對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 結(jié)果 1、分離純化人牙周膜細(xì)胞及其生物學(xué)特性：采用克隆化培養(yǎng)方法和免疫磁珠法對(duì)人牙周膜細(xì)胞進(jìn)行分離純化，獲得的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞形態(tài)；通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定，可見(jiàn)篩選純化的牙周膜細(xì)胞較未篩選純化的牙周膜混合細(xì)胞生長(zhǎng)慢，具有慢增殖周期的干細(xì)

6、胞特點(diǎn)。 2、純化后的人牙周膜細(xì)胞的初步鑒定：將篩選分離的牙周膜細(xì)胞通過(guò)透射電鏡和流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所分離的細(xì)胞具有干細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞周期特點(diǎn)，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)該細(xì)胞表面相對(duì)特異性蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞標(biāo)志、未分化的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志、礦化基質(zhì)形成細(xì)胞標(biāo)志。提示所分離的細(xì)胞是間充質(zhì)來(lái)源的、未分化的、有礦化基質(zhì)形成潛能的細(xì)胞。 3、人牙周膜干細(xì)胞的礦化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：將該細(xì)胞礦化誘導(dǎo)14d后，細(xì)胞形態(tài)

7、明顯發(fā)生極化；15d左右孔板底部出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)針尖大小灰白色小結(jié)節(jié)，并逐漸增大，Vonkossa染色可見(jiàn)染成褐紅色的礦化結(jié)節(jié)，周邊界限不清。有礦化相關(guān)蛋白ON、BSP的表達(dá)；表明細(xì)胞礦化誘導(dǎo)后出現(xiàn)向成骨細(xì)胞分化。 4、人牙周膜干細(xì)胞的神經(jīng)誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)：將所獲得的細(xì)胞向神經(jīng)方向做定向誘導(dǎo)，結(jié)果誘導(dǎo)4h后出現(xiàn)向神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并表達(dá)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白NSE、GFAP的表達(dá)。提示誘導(dǎo)的細(xì)胞分化為神經(jīng)元、神經(jīng)

8、膠質(zhì)樣細(xì)胞。 結(jié)論 1、克隆化培養(yǎng)和免疫磁珠分離可獲得PDLSC，具有一定的成骨/成牙骨質(zhì)細(xì)胞特性。 2、實(shí)驗(yàn)所獲得的細(xì)胞具有成體干細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，是間充質(zhì)來(lái)源的、未分化的、有礦化基質(zhì)形成潛能的細(xì)胞。 3、PDLSC在礦化液的誘導(dǎo)作用下出現(xiàn)向成骨、成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化。 4、PDLSC在一定條件下可向神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞分化。 5、可嘗試將PDLSC作為種子細(xì)胞，用于牙