白介素18對胰腺癌免疫治療作用及其機制的研究.pdf

1、第一部分 IL-18在胰腺癌組織及胰腺癌患者血漿中表達的檢測
　　目的：篩選胰腺癌潛在的免疫治療因子，并擴大樣本量在胰腺癌組織和胰腺癌患者血漿中進行檢測。
　　方法：采用RayBiotech Human Cytokine Array分析3例胰腺癌及健康對照血漿中差異表達的細胞因子，結合本實驗組胰腺癌表達譜基因芯片數(shù)據，初步確定研究對象； E-LISA檢測104例胰腺癌患者、35例胰腺良性腫瘤患者、27例十二指腸腫瘤患者、77

2、例膽管癌患者、8例肝癌患者、22例胰腺炎患者、38例健康對照血漿中IL-18的表達，并分析IL-18表達量與胰腺癌預后的關系；免疫組織化學檢測112例胰腺癌及相應癌旁正常胰腺組織中IL-18的表達，并分析IL-18表達量與臨床病理、臨床分期以及預后的關系。
　　結果：
　　1.RayBiotech Human Cytokine Array示差異性表達細胞因子23個，其中胰腺癌患者血漿中高表達11個、低表達12個，在高表達的細

3、胞因子中，IL-18差異最明顯；胰腺癌組織基因芯片數(shù)據分析顯示 IL-18在胰腺癌與免疫系統(tǒng)的相互作用中可能發(fā)揮重要作用。
　　2.IL-18在胰腺癌患者血漿中的表達量相對胰腺良性腫瘤、十二指腸腫瘤、膽管癌、肝癌、胰腺炎患者高表達；在胰腺癌患者中，手術前3天IL-18的表達量要比手術后3天的高（p＜0.01）；IL-18的表達量與胰腺癌生存期呈正相關（p＜0.05）。
　　3.IL-18在胰腺癌組織中相對應癌旁正常胰腺組織呈

4、明顯的高表達（p＜0.001），且IL-18的表達量與是否發(fā)生侵襲轉移（p＜0.05）和AJCC臨床分期密切相關；IL-18在胰腺癌組織中的表達量與生存期呈負相關（p＜0.001）。
　　結論：
　　1. IL-18可能在胰腺癌與免疫系統(tǒng)的相互作用中發(fā)揮重要作用，可以作為進一步的研究對象。
　　2.IL-18在胰腺癌患者血漿中高表達，且與生存期呈正相關；IL-18在胰腺癌組織中高表達，且與生存期呈負相關。
　　第

5、二部分單用IL-18對胰腺癌免疫治療作用的研究
　　目的：明確IL-18對常見免疫細胞亞群的影響，并確定重組IL-18對免疫功能正常和免疫缺陷的胰腺癌原位移植小鼠生存時間的影響。
　　方法：
　　1.分離健康志愿者PBMC，體外培養(yǎng)，IL-18干預后，CCK-8檢測PBMC增殖情況，流式細胞術檢測常見免疫細胞亞群的比例變化。
　　2.C57BL/6J鼠腹腔注射重組鼠IL-18一周，分離脾臟和腹腔淋巴結免疫細胞，流

6、式細胞術檢測常見免疫細胞亞群比例的變化。
　　3.構建IL-18﹣/﹣C57BL/6J鼠，分離脾臟和腹腔淋巴結免疫細胞，流式細胞術檢測常見免疫細胞亞群比例的變化。
　　4.篩選8周大C57BL/6J鼠和Balb/c裸鼠，采用鼠胰腺癌細胞系LTPA構建胰腺癌原位移植模型，鼠重組IL-18干預，監(jiān)測小鼠生長狀態(tài)和生存時間。
　　結果：
　　1. IL-18可以促進PBMC的增殖（p＜0.05），顯著增加Tc細胞（p＜

7、0.001）和NK細胞（p＜0.05）細胞的比例。
　　2.IL-18顯著增加小鼠脾臟和淋巴結中Tc細胞和NK細胞的比例，結果具有統(tǒng)計學意義。
　　3.相對于野生型C57BL/6J小鼠，IL-18基因敲出鼠脾臟和淋巴結中的Tc細胞（p＜0.05）和NK細胞（p＜0.05）細胞比例顯著下降。
　　4.在C57BL/6J鼠胰腺癌原位移植模型中，IL-18對小鼠體重增長曲線和生存曲線無影響；在Balb/c裸鼠胰腺癌原位移植模

8、型中，IL-18干預組小鼠生存時間縮短（p＜0.01），更早開始出現(xiàn)體重下降等惡病質表現(xiàn)。
　　結論：
　　1. IL-18在體內外實驗中上調Tc細胞和NK細胞的比例。
　　2.在免疫功能正常的C57BL/6J小鼠胰腺癌原位移植模型中，單用重組IL-18并不能起到治療的作用；在免疫缺陷的 Balb/c裸鼠胰腺癌原位移植模型中，重組 IL-18干預反而促進腫瘤的發(fā)展，縮短荷瘤小鼠生存時間。
　　第三部分 IL-18

9、對胰腺癌增殖侵襲轉移的影響及其機制的研究
　　目的：研究IL-18在體內外對胰腺癌增殖和侵襲轉移的影響并探討其機制
　　方法：
　　1.構建IL-18過表達、沉默慢病毒載體，轉染人胰腺癌細胞系panc-1和mia-paca-2。CCK-8實驗、胰腺癌3D培養(yǎng)模型、transwell實驗及劃痕實驗檢測IL-18在體外對胰腺癌增殖、侵襲轉移的影響。人重組IL-18干預panc-1和mia-paca-2后，CCK-8實驗、胰

10、腺癌3D培養(yǎng)模型，transwell實驗檢測IL-18在體外對胰腺癌增殖、侵襲轉移的影響。
　　2.構建Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型和胰腺癌Balb/c裸鼠脾臟種植肝轉移模型，監(jiān)測裸鼠移植瘤增長情況和體重增長情況，利用肝臟病理切片檢測其對胰腺癌體內遠處轉移能力的影響。
　　3.基因芯片數(shù)據分析IL-18影響胰腺癌增殖和侵襲轉移的可能機制；western blot、EMSA、雙熒光報告素酶實驗、免疫熒光實驗驗證IL-18是否

11、激活NF-κB信號通路；CCK-8實驗、transwell實驗驗證IL-18是否通過NF-κB信號通路影響胰腺癌的增殖和侵襲轉移；real-time PCR、ChIP、western blot實驗確定IL-18激活NF-κB信號通路后的靶基因。
　　結果：
　　1.上調IL-18表達可顯著增強胰腺癌細胞系panc-1、mia-paca-2的體外增殖、侵襲、遷移能力，下調IL-18表達可抑制增殖、侵襲、遷移能力；人重組IL-1

12、8干預增強胰腺癌細胞系panc-1、mia-paca-2的體外增殖、侵襲、遷移能力；相對于對照組，結果均有統(tǒng)計學意義。
　　2.上調IL-18表達可促進胰腺癌細胞系panc-1、mia-paca-2皮下移植瘤的生長，裸鼠在第5周逐漸出現(xiàn)體重下降等惡病質表現(xiàn)，下調IL-18表達顯著抑制皮下移植瘤的形成和生長，實驗裸鼠在8周實驗內體重穩(wěn)定增加；相對于對照組，結果均有統(tǒng)計學意義。
　　3.上調IL-18表達可增加胰腺癌肝轉移灶，顯

13、著縮短荷瘤小鼠生存時間；下調IL-18表達可減少胰腺癌肝轉移灶，顯著延長荷瘤小鼠生存時間；相對于對照組，結果均有統(tǒng)計學意義。
　　4.IL-18可以通過促進IKKα/β的磷酸化激活NF-κB信號通路，IL-18通過NF-κB信號通路影響胰腺癌的增殖和侵襲，靶基因是MMP-3、MMP-9、c-myc和cyclin-D1，NF-κB信號通路阻滯劑BAY11-7082可以阻斷IL-18對胰腺癌增殖和侵襲轉移的促進作用。
　　結論：

14、
　　1. IL-18可以增強胰腺癌的增殖和侵襲轉移能力。
　　2.IL-18調控NF-κB信號通路影響胰腺癌的增殖和侵襲轉移能力，NF-κB信號通路阻滯劑BAY11-7082可以特異性阻斷IL-18對胰腺癌增殖和侵襲轉移的促進作用。
　　第四部分選擇性阻斷其促瘤效應后IL-18對胰腺癌免疫治療作用的研究
　　目的：研究選擇性阻斷IL-18對胰腺癌增殖和侵襲轉移的促進作用后，重組IL-18是否對胰腺癌具有免疫治療

15、作用。
　　方法：
　　1.構建沉默鼠IL-18慢病毒載體，轉染鼠胰腺癌細胞系LTPA，C57BL/6J和IL-18﹣/﹣C57BL/6J小鼠構建鼠胰腺癌原位移植模型，分為四個組i) LTPA/C57BL/6J、ii) IL-18KD/C57BL/6J、iii) LTPA/IL-18﹣/﹣C57BL/6J、iv) IL-18KD/IL-18﹣/﹣C57BL/6J，監(jiān)測生存時間，生長狀態(tài)，肝臟、肺臟病理切片檢測遠處微轉移灶。<

16、br>　　2.采用鼠胰腺癌細胞系LTPA和C57BL/6J小鼠，構建鼠胰腺癌原位抑制模型，分為四個組i) PBS、ii) IL-18、iii) BAY11-7082、iv) IL-18聯(lián)合BAY11-7082，監(jiān)測生存時間和生長狀態(tài)。
　　結果：
　　1. IL-18KD/C57BL/6J組小鼠長期生存，生長狀態(tài)最好；LTPA/IL-18﹣/﹣C57BL/6J生存時間最短，生存狀態(tài)最差，結果具有統(tǒng)計學意義。肝臟和肺臟 HE病

17、理切片示IL-18KD/C57BL/6J組小鼠無微轉移灶，LTPA/IL-18﹣/﹣C57BL/6J組小鼠肝臟、肺臟微轉移灶最多，結果具有統(tǒng)計學意義。
　　2.IL-18聯(lián)合BAY11-7082組小鼠可以長期生存，其他三組生存時間和生存狀態(tài)無明顯差異；IL-18聯(lián)合BAY11-7082組與其他三組相比，結果具有統(tǒng)計學意義。
　　結論：只有采用BAY11-7082選擇性阻斷IL-18對胰腺癌的增殖和侵襲轉移促進作用后，IL-1