芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)β-地中海貧血及無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的研究.pdf

1、地中海貧血是世界上最常見(jiàn)的單基因遺傳病之一，同時(shí)也是我國(guó)南方地區(qū)最常見(jiàn)的遺傳病，重癥地中海貧血終生需要輸血且死亡率高，產(chǎn)前診斷是預(yù)防重癥地中海貧血唯一有效的措施。孕婦外周血胎兒有核紅細(xì)胞、游離胎兒DNA、mRNA的發(fā)現(xiàn)為無(wú)創(chuàng)傷性獲得胎兒遺傳物質(zhì)提供了新的機(jī)會(huì)，促進(jìn)了無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的發(fā)展,獲取的這些微量胎兒遺傳物質(zhì)己漸漸用于胎兒性別、核型、胎兒Rh血型等方面的檢測(cè)，另外從受精卵分裂中取得單個(gè)胎兒細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展也促進(jìn)了胚胎移

2、植前產(chǎn)前診斷，然而這些研究都難以推廣應(yīng)用于臨床，它們都面臨較嚴(yán)峻的問(wèn)題：即樣本量少，對(duì)檢測(cè)技術(shù)方法的靈敏性提出了很高的要求。芯片毛細(xì)管電泳具有快速、方便、所需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)，將其用于產(chǎn)前診斷有望提高解決目前基因檢測(cè)速度慢、靈敏度低、檢測(cè)所需樣本量較多等問(wèn)題，為無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供新的策略或手段。 目的：通過(guò)芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)β-地中海貧血，為應(yīng)用于臨床地中海貧血無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷、受精卵移植前診斷打下了基礎(chǔ)，同時(shí)基于片段長(zhǎng)度差異建立了

3、芯片毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)基因突變的技術(shù)平臺(tái)，為臨床疾病相關(guān)基因突變的篩查和診斷提供了一種快速、靈敏的技術(shù)手段。本研究擬開(kāi)展了如下工作： 1、質(zhì)粒樣本構(gòu)建：遺傳病檢測(cè)的研究中病例基因組樣本一般不容易獲得，它是制約實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的重要因素，如何取得足量的研究樣本是本實(shí)驗(yàn)首先需要解決的問(wèn)題。構(gòu)建β-地中海貧血點(diǎn)突變克隆，為突變基因樣本做準(zhǔn)備。其次，通過(guò)引物延伸反應(yīng)建立穩(wěn)定的β-地中海貧血檢測(cè)條件，完成野生型和突變型引物單獨(dú)檢測(cè)，初步保證檢

4、測(cè)引物工作的特異性和靈敏性。 2、建立多重PCR反應(yīng)體系，通過(guò)具有較高分辨能力的DHPLC完成β-地中海貧血多位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)，保證六個(gè)位點(diǎn)多重引物延伸反應(yīng)的可行性；同時(shí)也為DHPLC與芯片毛細(xì)管電泳的區(qū)分度、靈敏度的比較奠定基礎(chǔ)。 3、構(gòu)建芯片毛細(xì)管電泳變性膠檢測(cè)點(diǎn)突變的技術(shù)平臺(tái)，以完成β-地中海貧血多位點(diǎn)野生型和突變型共同檢測(cè)的目標(biāo)。最終，通過(guò)芯片毛細(xì)管電泳實(shí)現(xiàn)β-地中海貧血快速、微量、準(zhǔn)確地檢測(cè)，為產(chǎn)前診斷提供一種快速

5、、靈敏的技術(shù)手段。 方法：研究?jī)?nèi)容分為以下三個(gè)部分： 1、構(gòu)建突變質(zhì)粒模板，建立穩(wěn)定的引物延伸反應(yīng)檢測(cè)體系 (1)首先建立包括六個(gè)位點(diǎn)的β-珠蛋白基因正常序列克隆，然后通過(guò)定點(diǎn)突變的方法突變克隆中正常基因位點(diǎn)的堿基序列，分別構(gòu)建含有β-珠蛋白基因突變位點(diǎn)的基因克隆，通過(guò)測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。 (2)設(shè)計(jì)檢測(cè)各位點(diǎn)的引物，不但要避免引物間二聚體形成，同時(shí)要使所有引物長(zhǎng)度、退火溫度等相近，以保證多重引物延伸反應(yīng)的順利

6、進(jìn)行。為提高引物延伸反應(yīng)的特異性，采用三溫循環(huán)反應(yīng)程序，并對(duì)影響檢測(cè)反應(yīng)的各因素進(jìn)行研究和優(yōu)化，包括反應(yīng)程序、引物濃度、引物序列、離子濃度、退火溫度、人工錯(cuò)配引物等影響因素的研究，以提高檢測(cè)反應(yīng)的特異性和靈敏性，初步建立具有區(qū)分正?；蛐秃屯蛔兓蛐湍芰Φ臋z測(cè)體系。 (3)為了后續(xù)能在一個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)同時(shí)區(qū)分野生型和突變型擴(kuò)增產(chǎn)物，我們?cè)谝吧蜋z測(cè)引物5’端加上10個(gè)或20個(gè)非特異性的堿基序列，基于核酸片段長(zhǎng)度差異在單管反應(yīng)中可同時(shí)

7、區(qū)分野生型和突變型，以此同時(shí)辨別六個(gè)位點(diǎn)的純合子和雜合子基因型。 2、多重引物延伸反應(yīng)檢測(cè)β-地中海貧血 建立多重引物延伸反應(yīng)體系，將六個(gè)位點(diǎn)的野生型、突變型引物同時(shí)在單管中反應(yīng)，采用具有較高分辨能力的DHPLC檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)多重引物延伸實(shí)驗(yàn)完成β-地中海貧血六個(gè)位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)。 3、通過(guò)芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)β-地中海貧血 (1)構(gòu)建雙通道芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)平臺(tái)，包括毛細(xì)管電泳芯片、激光共聚焦檢

8、測(cè)裝置、信號(hào)收集輸出裝置的搭建和優(yōu)化；然后對(duì)檢測(cè)膠的制作工藝、濃度等條件進(jìn)行研究，提高其對(duì)長(zhǎng)度差異核酸片段的區(qū)分能力；通過(guò)對(duì)核酸酶切產(chǎn)物、微衛(wèi)星標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)，評(píng)估系統(tǒng)的區(qū)分度和重復(fù)性。 (2)通過(guò)多重引物延伸反應(yīng)將β-地中海貧血六個(gè)位點(diǎn)的野生型和突變型引物同時(shí)檢測(cè)每個(gè)待檢樣品。采用熒光Cy3和Cy5分別標(biāo)記地中海貧血標(biāo)準(zhǔn)品和待檢品，通過(guò)芯片毛細(xì)管電泳雙通道同時(shí)檢測(cè)，將待檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)位比較，以辨別各樣品的基因型，包括正?；?/p>

9、因型、雜合子、突變純合子的檢測(cè)，通過(guò)臨床病例樣本完成β-地中海貧血芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)平臺(tái)的驗(yàn)證。 (3)收集孕婦夫妻雙方均為地中海貧血患者或攜帶者的家庭進(jìn)行產(chǎn)前診斷，分別獲取孕婦外周血漿、羊水或臍血樣本，采用試劑盒及芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)平臺(tái)同時(shí)進(jìn)行β-地中海貧血的產(chǎn)前診斷，分析和比較不同檢測(cè)方法得到的胎兒基因型結(jié)果。 結(jié)果： 1、通過(guò)定點(diǎn)突變方法成功構(gòu)建了β-地中海貧血六個(gè)突變位點(diǎn)克隆，經(jīng)測(cè)序完全正確。 引

10、物延伸反應(yīng)體系的研究中，設(shè)計(jì)的引物工作較好，無(wú)明顯引物二聚體產(chǎn)生。采用三溫循環(huán)反應(yīng)較傳統(tǒng)單溫循環(huán)反應(yīng)具有較高的特異性，在三溫循環(huán)中退火溫度、循環(huán)次數(shù)對(duì)反應(yīng)的擴(kuò)增效率及特異性有明顯的影響，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)第二循環(huán)反應(yīng)溫度采用67度時(shí)適合所有位點(diǎn)檢測(cè)引物的擴(kuò)增，且擴(kuò)增效率高、無(wú)非特異性擴(kuò)增；同時(shí)引物延伸反應(yīng)還受離子濃度、引物濃度、引物序列等因素的影響，對(duì)以上因素的調(diào)節(jié)有助于建立最佳的反應(yīng)檢測(cè)條件。在實(shí)驗(yàn)中為了降低單堿基差異檢測(cè)的難度、提高

11、檢測(cè)引物的特異性和辨別力，我們?cè)谝镄蛄兄幸肴斯ゅe(cuò)配堿基，發(fā)現(xiàn)其增大了野生型和突變型引物間的差異，解決了單堿基差異檢測(cè)中非特異性擴(kuò)增的難題。通過(guò)凝膠電泳的檢測(cè)初步建立了具有較高穩(wěn)定性、特異性的檢測(cè)體系，以β-地中海貧血患者樣本為檢測(cè)模板上進(jìn)行了驗(yàn)證，每個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果都符合試劑盒檢測(cè)結(jié)果或測(cè)序結(jié)果。 在引物加尾實(shí)驗(yàn)的研究中，我們發(fā)現(xiàn)加入10個(gè)或20個(gè)非特異的T堿基不但不會(huì)影響反應(yīng)的退火溫度，而且也沒(méi)有造成引物二聚體，可較好的工作

12、而不影響多重引物延伸反應(yīng)?？捎糜谙乱徊交谄伍L(zhǎng)度通過(guò)芯片毛細(xì)管檢測(cè)的研究。 2、通過(guò)多重引物延伸反應(yīng)對(duì)β-地中海貧血六個(gè)位點(diǎn)同時(shí)擴(kuò)增，采用DHPLC檢測(cè)不同位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物，調(diào)節(jié)洗滌液的濃度及檢測(cè)時(shí)間提高DHPLC檢測(cè)的區(qū)分度，實(shí)現(xiàn)了六位點(diǎn)野生型或突變型同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。 3、通過(guò)芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)β-地中海貧血：構(gòu)建了芯片毛細(xì)管電泳變性膠檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，在材料方面我們采用高分子為原材料可下降檢測(cè)成本及實(shí)現(xiàn)再利用；檢測(cè)裝置為公司

13、自產(chǎn)的激光共聚焦掃描儀改裝而成，采用共聚焦光路，大大提高了檢測(cè)底限，同時(shí)儀器還集成了632nm和532nm兩種激光器以及各自的濾光片，因而能夠?qū)崿F(xiàn)Cy5、Cy3雙通道同時(shí)采集；新的光路采用了激發(fā)光入射到芯片管道上，大部分的反射光經(jīng)過(guò)反射鏡的透射孔透射出去。其有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)，第一是反射鏡上有一個(gè)透射孔，可以透過(guò)絕大部分的反射激光，降低背反射激光的影響；第二是采用共聚焦光路，使得非焦點(diǎn)位置的雜散光不能透過(guò)針孔，再一次降低了背景噪音。通過(guò)變性膠濃

14、度以及制備程序等方面優(yōu)化提高芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)能力，采用3％的HPC膠時(shí)，檢測(cè)區(qū)分能力較好，可區(qū)分100-200bp和300-400bp間相差4bp的不同長(zhǎng)度核酸片段。在檢測(cè)β-地中海貧血標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)驗(yàn)中，完成了對(duì)100-600bp間相差10bp不同長(zhǎng)度片段的區(qū)分，并且建立的標(biāo)準(zhǔn)品和待檢品雙通道檢測(cè)體系，其穩(wěn)定性、重復(fù)性好，通過(guò)芯片毛細(xì)管電泳完成了臨床病例樣本多位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)，可檢測(cè)六個(gè)位點(diǎn)純合子、雜合子基因型，芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)所有樣本的

15、結(jié)果與試劑盒檢測(cè)的結(jié)果完全一致。 此檢測(cè)系統(tǒng)平臺(tái)僅需要0.5ng/μl的基因組樣本，1μl的檢測(cè)樣本(0.04nM)，檢測(cè)時(shí)間只需要200s，實(shí)現(xiàn)了快速、微量檢測(cè)的目標(biāo)。將檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行β-地中海貧血無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的研究，檢測(cè)的結(jié)果與臍血或羊水基因檢測(cè)結(jié)果一致。其所需樣本量非常少、快速的優(yōu)點(diǎn)為無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法提供的一種新的選擇。 結(jié)論： 1、完成了從質(zhì)粒構(gòu)建、引物延伸反應(yīng)到遺傳病檢測(cè)一套完整的方法體系，點(diǎn)突變質(zhì)粒

16、的構(gòu)建為解決遺傳病檢測(cè)樣本的不足提供了一種便捷的方法，引物延伸反應(yīng)影響因素的全面研究為快速建立引物延伸反應(yīng)條件奠定了基礎(chǔ)，這些方法可用于其他相關(guān)遺傳病檢測(cè)的研究和應(yīng)用。同時(shí)建立了β-地中海貧血多重引物延伸反應(yīng)采用凝膠進(jìn)行檢測(cè)的方法，此方法簡(jiǎn)單、材料普通而便宜，可用于基層醫(yī)院的篩查使用。 2、建立了芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)遺傳病基因點(diǎn)突變的技術(shù)平臺(tái)，完成了β-地中海貧血微量樣品的快速檢測(cè)，為外周血胎兒游離DNA及胚胎移植前遺傳病診斷等微