應(yīng)用熒光定量PCR法對(duì)白色念珠菌胞外DNA釋放的動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、侵襲性真菌病是導(dǎo)致免疫缺陷病人和危重病人死亡的主要原因之一。隨著腫瘤、血液病及獲得性免疫缺陷病人的逐年增多，侵襲性真菌病特別是白色念珠菌病日益受到醫(yī)學(xué)界的重視。其中，白色念珠菌感染可占臨床念珠菌感染的45％左右。本病危害性大、死亡率高，尚缺乏有效的診斷手段。常規(guī)血液培養(yǎng)陽性率低、耗時(shí)長(zhǎng)；檢測(cè)真菌循環(huán)抗原(體)、特異性酶和代謝產(chǎn)物的血清學(xué)方法則存在特異性和敏感性低的缺陷。檢測(cè)方法的局限性導(dǎo)致真菌病的早期明確診斷十分困難，是影響患者預(yù)后的重

2、要因素之一。因而建立一種特異、靈敏、高效、快速的檢測(cè)系統(tǒng)是檢驗(yàn)工作者急需解決的一個(gè)問題。 PCR法可以檢測(cè)出微量的真菌DNA，已成為真菌檢測(cè)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。而RealTimePCR，即實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行解析的方法，不僅秉承和發(fā)展了普通PCR的快速、高靈敏度檢出等全部?jī)?yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了普通PCR不能準(zhǔn)確定量、容易污染等的不足。由于其操作簡(jiǎn)單、快速方便、靈敏度高、重復(fù)性好、污染率低等特點(diǎn)，近年來開始受到真菌檢測(cè)研究者的關(guān)注。

3、 無論是普通PCR法還是RealTimePCR法檢測(cè)菌株的目的都是要為臨床服務(wù)，所以臨床標(biāo)本的選擇很重要。選用血液標(biāo)本早己達(dá)成共識(shí)，但具體而言，全血標(biāo)本和血清標(biāo)本哪一種更利于真菌的PCR早期檢測(cè)，仍然說法不一；并且如何更早地獲得足夠量的檢測(cè)模板也是一個(gè)急需解決的問題。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)試圖通過熒光定量PCR法研究白色念珠菌體外DNA釋放的動(dòng)態(tài)過程，嘗試用RealTimePCR法檢測(cè)真菌，為指導(dǎo)臨床早期檢測(cè)侵襲性真菌病提供一定的依據(jù)。

4、 本研究以白色念珠菌rRNA基因復(fù)合體為靶標(biāo)，采用prime5．O軟件包設(shè)計(jì)了一對(duì)白色念珠菌特異性引物，以白色念珠菌DNA為模板，并以其他菌種的念珠菌屬及臨床上常見的細(xì)菌DNA為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示該引物的特異性良好。將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該測(cè)序結(jié)果與目的基因序列相同，進(jìn)一步證實(shí)了PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和可靠性。 通過系列稀釋提取的白色念珠菌的核酸，發(fā)現(xiàn)使用常規(guī)PCR儀(Biometra公司)檢

5、測(cè)白色念珠菌DNA的靈敏度是100fg或者10一20個(gè)菌；而使用熒光定量PCR儀HghtCycler1．0系統(tǒng)(羅氏公司)檢測(cè)白色念珠菌DNA的靈敏度是10fg。 在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，觀察白色念珠菌DNA釋放到胞外的動(dòng)態(tài)過程。通過8個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)提取上清中DNA量的變化情況，觀察了白色念珠菌在4種不同培養(yǎng)基中隨時(shí)間變化釋放到胞外的動(dòng)態(tài)過程，以及加入單核吞噬細(xì)胞后對(duì)白色念珠菌DNA釋放的影響程度。 為進(jìn)一步驗(yàn)證血清和全血沉淀

6、物中DNA的主要存在方式，我們?cè)O(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)，即在人全血中加入白色念珠菌孢子(代表真菌細(xì)胞內(nèi)的DNA)和光滑念珠菌基因組DNA(代表游離DNA)。經(jīng)離心后得到上清和沉淀物，分別提取DNA后，以白色念珠菌和光滑念珠菌特異的引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示游離DNA主要存在于血漿中，而真菌細(xì)胞內(nèi)的DNA主要存在于全血沉淀物中。 綜上所述，本研究采用熒光定量PCR的方法，觀察了白色念珠菌DNA釋放到胞外的動(dòng)態(tài)過程，發(fā)現(xiàn)單核吞噬細(xì)胞在