皮下多發(fā)脂肪瘤致病相關(guān)基因分析.pdf

1、研究背景
　　 脂肪瘤(lipoma)是由成熟脂肪組織增生而形成的良性腫瘤，既有的大多數(shù)教科書認為此病可發(fā)生于任何年齡，但多見于40～60歲的成年人。由于絕大多數(shù)的脂肪瘤不會惡變，無特殊不適癥狀和并發(fā)癥，易于診斷，治療手段單一(目前多以手術(shù)切除為主)，因此，對脂肪瘤的全面研究未能引起足夠的重視，其研究進展也相對較慢。在臨床工作中，大多數(shù)醫(yī)生會注意到，對于單發(fā)脂肪瘤，手術(shù)基本可以治愈，預(yù)后良好，而對于皮下多發(fā)脂肪瘤患者，此病雖不至

2、于危及生命，但會使患者終日憂心于腫瘤的不斷進展和苦于找不到徹底根治的方法和手段，從而嚴重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。更為重要的是，隨著社會飛速進步帶來的壓力增大、不良生活習(xí)慣增加及飲食結(jié)構(gòu)的變化，皮下多發(fā)脂肪瘤的發(fā)病率異常增高，門診患者中此類疾病幾乎每日可見，而且大多數(shù)此病患者都具有父代或子代皆有發(fā)病的家族傾向，這就使得針對此病的研究顯得頗為重要和十分必要。
　　 20世紀90年代中后期，國外學(xué)者在軟組織腫瘤的細胞和分子遺傳學(xué)

3、研究中取得了突破性進展，包括針對脂肪瘤的分子遺傳學(xué)研究，基本證實脂肪瘤細胞發(fā)生了染色體易位、重排或融合，這些遺傳學(xué)異常導(dǎo)致了相應(yīng)基因的突變和擴增。研究結(jié)果顯示：55～57％的脂肪瘤病例存在染色體異常，主要涉及12q13-15，少數(shù)涉及6p21-23，或丟失13q中的一些成分。位于12q15區(qū)帶上的HMGIC基因(high mobility group IC gen，腫瘤相關(guān)基因高遷移率蛋白IC)重排，現(xiàn)認為在脂肪瘤的發(fā)生過程中起了主要作

4、用。研究顯示，t(3:12)(q27-28；q13-15)導(dǎo)致位于12q15上的HMGIC基因與位于3q27-28上的LPP基因融合形成HMGIC-LPP融合基因，斷裂點分別為HMGIC基因為3號內(nèi)顯子，LPP基因為8號內(nèi)顯子。除t(3；12)(p27-28；q13-15)外，文獻上還報道了1例t(12；13)(q13-15；q12)，使HMGIC基因與LHFP基因發(fā)生融合。遺憾的是，這些染色體遺傳學(xué)改變后引起哪些相應(yīng)的基因發(fā)生變化，這

5、些變化基因的下游基因表達如何，其報道很少。從流行病學(xué)角度來看，目前，比較公認的與脂肪瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的因素主要有如下幾種：1.遺傳因素，臨床中可見父代單發(fā)脂肪瘤，子代出現(xiàn)多發(fā)脂肪瘤或父代多發(fā)，而子代單發(fā)或多發(fā)的情況，這與上述染色體改變學(xué)說剛好能夠互為呼應(yīng)；2.生活習(xí)慣不良，如過度飲酒、高脂飲食、熬夜等；3.生活或工作壓力過大。從文獻檢索來看，近年來，國內(nèi)外關(guān)于脂肪異常增生性疾病的研究更多傾向于多發(fā)性對稱性脂肪瘤病以及肥胖的研究，從這

6、些研究中也可以給我們一定的借鑒經(jīng)驗，對于染色體異常所導(dǎo)致的下游基因改變的研究具有相當(dāng)大的參考價值。通過網(wǎng)絡(luò)信息檢索，國內(nèi)也有言論稱脂肪瘤致瘤因子是脂肪瘤形成的真正原因。提出這一理論的人員推測在脂肪瘤患者體細胞內(nèi)存在一種致瘤因子，在正常情況下，這種致瘤因子處于一種失活狀態(tài)(無活性狀態(tài))，不會發(fā)病，但在機體內(nèi)環(huán)境改變時，由于體內(nèi)的淋巴細胞、單核吞噬細胞等免疫細胞對致瘤因子的監(jiān)控能力下降，加之慢性炎癥刺激、全身脂肪代謝異常等誘因條件下，脂肪瘤

7、致瘤因子活性進一步增強與細胞內(nèi)的某些基因片斷結(jié)合，形成基因異常突變，導(dǎo)致脂肪組織沉積，最終形成脂肪瘤(http://www.clsbio.com)。筆者雖經(jīng)多方檢索，但遺憾的是未能找到針對此項論斷的專業(yè)文獻報道。但不可否認的是，脂肪瘤和其它腫瘤一樣，是正常細胞通過一系列的基因改變而轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞，這種改變可以是遺傳性或后天獲得性，在受到環(huán)境、飲食、輻射和病毒等因素影響引起染色體的變化，從而使mRNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生異常，產(chǎn)生過量腫瘤相關(guān)蛋白或結(jié)

8、構(gòu)異常的蛋白，導(dǎo)致細胞分裂和分化失控，通過多階段、多步驟轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞。因此，目前我們已知的是，脂肪瘤的發(fā)病是多因素相互作用的結(jié)果，那么這些因素最終是如何導(dǎo)致脂肪瘤的發(fā)生?在脂肪瘤形成過程中到底是哪些基因發(fā)生了改變?又為什么只是瘤變而多不惡變哪?這些問題的答案還未可知。
　　 針對上述問題，本課題擬通過基因芯片技術(shù)篩選出脂肪瘤與正常脂肪組織之間存在的相關(guān)差異基因，以期闡釋皮下多發(fā)脂肪瘤的發(fā)病機制，并為臨床治療提供可能的理論借鑒。

9、
　　 研究目的
　　 本研究旨在通過對皮下多發(fā)脂肪瘤患者的瘤體與周圍正常脂肪組織的基因差異分析，探索皮下多發(fā)脂肪瘤的相關(guān)基因表達，為臨床預(yù)防和治療提供可能的理論借鑒。
　　 研究方法
　　 一.樣本采集：來源為長海醫(yī)院整形外科門診收治的男性皮下多發(fā)脂肪瘤患者，排除全身系統(tǒng)性疾病，平素體健，年齡≤60歲，全身瘤體數(shù)量≥5個，所有瘤體直徑≤3cm，發(fā)病時間≤2年，目的是為了便于捕捉脂肪瘤瘤變早期的基因表達差

10、異。同時采集瘤體周圍正常脂肪組織作為自體對照樣本，排除個體差異所造成的基因差異，縮小篩選范圍。
　　 二.實驗分組：1.基因芯片檢測樣本采集自3個患者，共6個，包括脂肪瘤樣本3個(實驗組，n=3)和脂肪瘤周圍正常脂肪組織樣本3個(對照組，n=3)；2.人群散發(fā)皮下多發(fā)脂肪瘤樣本和自體對照正常脂肪樣本各3個(n=3)。
　　 三.組織病理學(xué)分析：通過大體觀察、組織病理學(xué)切片HE染色、脂肪組織特殊染色、脂肪瘤內(nèi)血管及神經(jīng)分布

11、，觀察脂肪瘤與正常脂肪組織之間的形態(tài)學(xué)共性和個性。
　　 四.基因芯片差異基因篩選：應(yīng)用AffymetrixHumanU133Plus2.0芯片(人類全基因組芯片)對實驗組和對照組共6個樣本進行基因檢測，所得檢測結(jié)果通過SBC生物芯片分析系統(tǒng)進行差異基因篩選，取差異倍數(shù)(foldchange)>2、p<0.05的基因為差異基因。將6張基因芯片篩選出的差異基因按照實驗組和對照組進行聚類分析，并根據(jù)分析結(jié)果對其功能進行綜合分析，初步

12、篩選出6個可能與脂肪瘤發(fā)生、增殖、信號傳導(dǎo)等功能改變相關(guān)基因作為重要差異基因。
　　 五.相關(guān)基因不同樣本驗證：將兩次取材的共6例實驗組樣本及6例對照組樣本進行6個重要差異基因的RT-PCR驗證，排除及證實基因芯片結(jié)果的可靠性，并綜合基因芯片及RT-PCR兩種檢測方法所得6個基因表達量的差異和分子生物學(xué)功能，初步探討這些基因在脂肪瘤發(fā)生及發(fā)展中可能的作用及機制。
　　 研究結(jié)果
　　 第一部分、皮下多發(fā)脂肪瘤的組

13、織病理學(xué)分析
　　 本課題取材的多發(fā)脂肪瘤均具有完整包膜，包膜細薄，可見少量血管分布，瘤體色黃，有一定韌性，剖面見脂肪組織質(zhì)地較均一，結(jié)締組織間隔較少，將瘤體分隔為大小不一的小葉。瘤體周圍正常脂肪組織無包膜，被纖維間隔分隔成豆大的小葉狀，單位體積內(nèi)間隔成分較脂肪瘤組織明顯增多。鏡下見脂肪瘤組織內(nèi)主要由分化成熟的脂肪細胞構(gòu)成，瘤體外周有薄的纖維組織間隔，纖維間隔向內(nèi)伸展，將瘤體分成各個大小不一的分葉，不同小葉間細胞大小也具有差異，

14、細胞擠壓呈圓形或多邊形，細胞內(nèi)含有大量脂滴脫失后形成的空泡，細胞核被擠壓偏位呈扁圓或新月狀。間隔內(nèi)有豐富的供血血管和其它類型細胞成分分布，小葉間排列緊密，小葉內(nèi)的脂肪細胞大小不一。正常脂肪組織纖維間隔豐富，組織松散，脂肪細胞形態(tài)大小較脂肪瘤組織更為均一相近，間隔成分主要為纖維結(jié)締組織。特殊染色顯示兩組的細胞內(nèi)脂滴油紅染色陽性。
　　 第二部分、皮下多發(fā)脂肪瘤致病相關(guān)基因的基因組學(xué)分析
　　 6例樣本的基因探針結(jié)合總數(shù)為5

15、4614個，脂肪瘤組和正常脂肪組間進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示兩組差異結(jié)合探針總數(shù)共1776個(p<0.05)，其中差異倍數(shù)大于兩倍的差異探針結(jié)合數(shù)共374個。經(jīng)聚類分析，初篩p<0.05，F(xiàn)oldchange>2的差異基因共260個。與細胞增殖相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因差異數(shù)為36個，其中上調(diào)基因30個，下調(diào)基因6個；2個凋亡抑制基因ERBB4和NPY5R下調(diào)7倍和4.425倍；具有凋亡雙向調(diào)節(jié)功能的SOX4上調(diào)2.3118倍，具有抗凋亡作用的COM

16、P和HGF分別上調(diào)5.9558和3.366倍，具有凋亡誘導(dǎo)作用的PERP下調(diào)2.387倍；脂類結(jié)合基因10個，其中上調(diào)基因5個，下調(diào)基因5個；脂類儲存正性調(diào)節(jié)基因1個，即載脂蛋白B基因(APOB)下調(diào)7倍(p=0.0044)；脂類儲存負向調(diào)節(jié)基因ABCG1上調(diào)2.5倍。另外，與腫瘤細胞增殖及調(diào)控相關(guān)的幾個基因ESM1、SOX11及HOXD10等較正常脂肪組的表達量分別增高32.81倍、31.01倍及13.99倍。結(jié)合各個基因的生物學(xué)功能

17、和表達差異，篩選ESM1、SOX11、HOXD10、ERBB4、NPY5R及APOB進行散發(fā)人群驗證。
　　 第三部分、差異基因的散發(fā)人群驗證
　　 應(yīng)用RT-PCR驗證樣本的脂肪瘤組ESM1、SOX11、HOXD10、ERBB4、NPY5R及APOB的表達與基因組學(xué)分析結(jié)果基本一致，結(jié)果顯示六個基因的表達差異與基因芯片結(jié)果一致，并且每個樣本的變化特點與基因芯片的信號強度變化完全符合，應(yīng)用RT-PCR檢測此六個基因的差異

18、表達結(jié)果分別為：ESM1上調(diào)18.51倍，SOX11上調(diào)19.18倍，HOXD10上調(diào)20.55倍，ERBB4下調(diào)16.68倍，NPY5R下調(diào)4.99倍，APOB下調(diào)15.05倍。散發(fā)人群的PCR結(jié)果同樣顯示了與基因芯片相一致的變化規(guī)律，ESM1上調(diào)290.86倍，SOX11上調(diào)6.13倍，HOXD10上調(diào)11.2倍，ERBB4下調(diào)5.09倍，NPY5R下調(diào)7.19倍，APOB下調(diào)15.05倍。既驗證了基因芯片結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，也驗

19、證了這六個差異基因在散發(fā)人群中的表達差異是確實存在的。
　　 研究結(jié)論
　　 本課題應(yīng)用基因芯片對皮下多發(fā)脂肪瘤瘤體與自體正常脂肪之間的差異基因進行初步篩選，并從中挑選出兩組差異倍數(shù)較大的致瘤相關(guān)基因3個(ESM1、SOX11、HOXD10)、細胞凋亡抑制基因2個(ERBB4和NPY5R)及脂類儲存調(diào)解基因1個(APOB)，通過熒光定量PCR方法在散發(fā)人群中進行驗證，初步證實皮下多發(fā)脂肪瘤的發(fā)生是由于致瘤基因的異常高表達