異種脫細胞真皮基質(zhì)微粒皮膚的構(gòu)建及其相關(guān)實驗研究.pdf

1、深度缺損創(chuàng)面的修復(fù)在燒燙傷、難治性皮膚潰瘍、瘢痕整形等的治療中有著重要意義。傳統(tǒng)的治療方法主要是移植自體皮或自體皮瓣，常常會出現(xiàn)供皮區(qū)色素沉積，瘢痕形成。當皮膚缺損面積較大時，自體皮還會供應(yīng)不足。皮膚組織工程(TE)的發(fā)展與應(yīng)用為改善創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量，解決皮源短缺問題，提供了一條嶄新的途徑。
　　近年來，脫細胞真皮基質(zhì)(ADM)成為組織工程皮膚研究中最有前景的真皮支架材料之一，ADM修復(fù)皮膚粘膜缺損和進行軟組織充填的有效性已經(jīng)被動物實

2、驗和初期臨床應(yīng)用實驗所證明，是一種較為理想的真皮替代物。由于同種異體ADM來源有限且受倫理限制，為此研究人員開發(fā)了豬的ADM。傳統(tǒng)方法制備的異種ADM，抗原性明顯強于同種異體ADM，移植后成活率降低且收縮明顯，組織學研究證實組織中有廣泛的炎癥反應(yīng)及膠原結(jié)構(gòu)破壞。目前，異種ADM的制備方法還缺乏統(tǒng)一標準，主要有高滲鹽水法、酶消化法、戊二醛交聯(lián)法、去垢劑法、NaOH消蝕法、凍融法等。每種方法單獨使用時都不能保證既充分去除所有的細胞和細胞碎片

3、，又保證真皮結(jié)構(gòu)完整，必須與其他方法聯(lián)合應(yīng)用方能獲得較理想的ADM支架材料。另一方面，ADM移植后的血管化及營養(yǎng)成分滲透等問題的解決，對提高ADM支架的實用性有著重要的臨床意義。
　　本課題在現(xiàn)有ADM制備方法的基礎(chǔ)上，制備一種新型異種ADM微粒，并利用成纖維細胞能夠分泌多種細胞外基質(zhì)、細胞因子和生長因子的特性，將成纖維細胞種植于異種ADM微粒上，探索構(gòu)建ADM微粒皮膚的可行性；并將ADM微粒皮膚注射到SD大鼠皮下和移植到全層損傷

4、模型，觀察ADM微粒皮膚對軟組織和創(chuàng)傷的修復(fù)能力，期望能夠收獲一種應(yīng)用方便，適用范圍廣的組織工程微粒皮膚產(chǎn)品，并為規(guī)模化、商品化生產(chǎn)微粒皮膚奠定一個良好的基礎(chǔ)。
　　本實驗的研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.改良消蝕法制備異種脫細胞真皮基質(zhì)微粒及其生物相容性評價
　　應(yīng)用機械法切除豬真皮乳頭層，結(jié)合胰酶消化、NaOH消蝕法和凍融法除去網(wǎng)狀真皮中的所有細胞，制備成ADM。將ADM切割成顆粒狀，對ADM微粒做細胞毒性實驗、細胞

5、相容性實驗、皮下埋藏實驗和免疫組化實驗檢驗其生物相容性。結(jié)果顯示ADM微粒大小較均勻呈瓷白色，有彈性，韌性好，質(zhì)地柔軟；三維結(jié)構(gòu)完整，膠原纖維稍松散但排列規(guī)則，相互交織成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙較多并均勻；成纖維細胞在ADM微粒上生長較好，在材料上有數(shù)層細胞生長；無明顯排異反應(yīng)，組織相容性良好，血管和成纖維細胞長入快。
　　2.異種ADM微粒皮膚的構(gòu)建及其性能研究
　　體外培養(yǎng)人成纖維細胞，用PKH26標記，將細胞與ADM微粒復(fù)合

6、構(gòu)建微粒皮膚，用熒光顯微鏡觀察、電鏡觀察和MTT法檢測組織工程微粒皮膚的性能。結(jié)果顯示，種植第2天，成纖維細胞在ADM微粒上能夠較好黏附，但增殖緩慢，之后細胞增殖明顯加快，10天時達到增殖高峰。成纖維細胞能在ADM微粒上很好的生長，構(gòu)建好的組織工程微粒皮膚上成纖維細胞呈多層生長，并分泌大量細胞外基質(zhì)。
　　3.異種ADM微粒皮膚皮下注射和SD大鼠全層皮膚損傷移植實驗
　　將帶熒光的豬ADM微粒皮膚，注射到SD大鼠皮下，用熒光

7、顯微鏡和HE觀察ADM微粒真皮對皮下組織的修復(fù)；將SD大鼠隨機分成3組，分別移植自體全厚皮膚、ADM微粒和ADM微粒皮皮膚。大體、熒光顯微鏡和HE觀察傷口愈合情況、計算創(chuàng)面愈合時間和收縮率。結(jié)果顯示ADM微粒皮下注射后一周可觀察到紅色熒光，提示種植的成纖維細胞具有活性。皮下注射ADM微粒皮膚8周時體積穩(wěn)定，膠原排列整齊，成纖維細胞數(shù)目少并穩(wěn)定，而單純ADM微粒皮下注射12周時體積才穩(wěn)定。皮膚移植修復(fù)全層皮膚損傷模型見：ADM微粒皮膚移植

8、和ADM微粒移植相比，血管化加快，特別是移植早期；ADM微粒皮膚對創(chuàng)面的修復(fù)，其愈合時間與自體全厚皮膚移植相當(P﹥0.05)，明顯好于單純ADM微粒移植(P﹤0.01)；創(chuàng)面收縮情況，ADM微粒皮膚與自體全厚皮膚移植相比無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)，與ADM微粒移植相比，差異顯著(P﹤0.01)。
　　綜上所述，我們所制備的豬ADM微粒是一種新型、免疫原性低、生物相容性好的真皮支架材料，用于構(gòu)建微粒皮膚具有實際可行性。體內(nèi)動物實