骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的可行性，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs是否參與創(chuàng)面血管形成。 方法：取臨床檢查無嚴(yán)重疾病的病人骨髓2ml，密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離MSCs，體外培養(yǎng)并傳代，行形態(tài)學(xué)觀察、掃描電鏡、透射電鏡、流式細(xì)胞儀和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。用L4(23)正交實(shí)驗(yàn)篩選誘導(dǎo)因子VEGF、bFGF，據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇誘導(dǎo)因子組合，誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs，行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、透射電鏡、掃描電

2、鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。取誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs，經(jīng)5-溴脫氧尿嘧啶(5-BrdU)標(biāo)記，與膠原蛋白海綿支架復(fù)合構(gòu)建組織工程真皮替代物，移植修復(fù)全層皮膚缺損創(chuàng)面，術(shù)后14天行創(chuàng)面組織切片免疫組織化學(xué)染色。 結(jié)果：經(jīng)密度梯度離心結(jié)合貼壁法獲得的MSCs，外觀呈長梭形或紡錘形，掃描電鏡示其細(xì)胞表面有短而粗的微絨毛突起，細(xì)胞周圍存在薄紗樣的細(xì)胞基質(zhì)，透射電鏡示細(xì)胞存在兩種不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)，分別與細(xì)胞所處的兩種功能狀態(tài)相對(duì)應(yīng)。流式細(xì)胞儀示大部分

3、MSCs處于相對(duì)靜息期，G0+G1期的細(xì)胞達(dá)85.35％，免疫細(xì)胞化學(xué)示MSCs細(xì)胞表面抗原CD29、CD44染色陽性，CD34、CD45、Ⅷ因子染色陰性。VEGF誘導(dǎo)組、bFGF誘導(dǎo)組和VEGF+bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)組的Ⅷ因子陽性率與MSCs組比較均有差異(P＜0.05)，以VEGF+bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)組的差異最具顯著性(P＜0.01)。經(jīng)VEGF、bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs，細(xì)胞外觀呈短梭形或扁圓形，掃描電鏡見細(xì)胞邊緣的微絨毛和細(xì)胞間

4、橋樣結(jié)構(gòu)，透射電鏡示其胞質(zhì)內(nèi)含有內(nèi)皮細(xì)胞特征性的WP小體，免疫細(xì)胞化學(xué)示MSCs細(xì)胞表面抗原CD34、Ⅷ因子染色陽性。經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs接種于膠原蛋白海綿支架后，細(xì)胞粘附良好。用其移植修復(fù)全層皮膚缺損創(chuàng)面，14天后見5-BrdU陽性細(xì)胞位于肉芽組織小血管周圍。 結(jié)論：經(jīng)密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離得到的MSCs具備干細(xì)胞的生物學(xué)特性；VEGF、bFGF均可在體外誘導(dǎo)MSCs分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞，VEGF比bFGF的誘導(dǎo)作用明顯，