β-NGF及受體在胰腺癌嗜神經(jīng)性中的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：從胰腺癌手術(shù)切除標(biāo)本、體外細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物模型三個(gè)層次探討β-NGF、TrKA、P75NGFR在胰腺癌神經(jīng)轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，著重研究體外胰腺癌MIAPaca-2細(xì)胞趨化、侵襲等生物學(xué)特性的變化；離體癌細(xì)胞、在體腫瘤組織、神經(jīng)組織中，β-NGF-NGFR生物軸系統(tǒng)表達(dá)的組織細(xì)胞特異性，且彼此之間可能的相互協(xié)同作用。從而探索β-NGF在神經(jīng)浸潤(rùn)中所起作用和可能的分子機(jī)制，為闡明胰腺癌嗜神經(jīng)性發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)、為將來(lái)尋找可能的作用靶點(diǎn)

2、提供參考。 方法：采用免疫組化法檢測(cè)胰腺癌組織中β-NGF、TrKA、P75NGFR、E-cadherin、MMP-2各指標(biāo)的表達(dá)、分布特點(diǎn)，并分析與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。體外培養(yǎng)未分化人胰腺癌MIAPaca-2細(xì)胞，應(yīng)用掃描和透射電鏡觀察β-NGF作用后癌細(xì)胞表面和內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的變化。MTT和FCM檢測(cè)外源性β-NGF、TrKA特異性拮抗劑K252a對(duì)MIAPaca-2增殖的影響。酶標(biāo)儀觀察β-NGF對(duì)癌細(xì)胞黏附能力影響。

3、劃痕/過(guò)河實(shí)驗(yàn)與Transwell侵襲小室觀察β-NGF對(duì)MIAPaca-2細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、趨化和侵襲能力的影響。Matrigel/癌細(xì)胞共培養(yǎng)72h后，Masson染色觀察癌細(xì)胞周圍人工基質(zhì)被融解情況。建立裸小鼠胰腺癌皮下和原位移植瘤動(dòng)物模型，用HE和硝酸銀染色檢測(cè)體內(nèi)神經(jīng)纖維的侵襲情況。電鏡觀察受侵襲神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)的破壞情況。RT-PCR、RealtimeRT-PCR、Westernbolt方法檢測(cè)在裸鼠體內(nèi)胰腺癌細(xì)胞中β-NGF、Tr

4、KA、P75NGFRmRNA、蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：手術(shù)標(biāo)本：β-NGF、TrkA、P75NGFR、E-cadherin及MMP-2均參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)幾率為56.25％(45/80)。β-NGF、TrkA可能與胰腺癌細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)。β-NGF與TrKA、MMP-2表達(dá)均呈正相關(guān)，與E-cad呈負(fù)相關(guān)，而與P75NGFR無(wú)相關(guān)性。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：人胰腺癌細(xì)胞系MIAPaca-2

5、為未分化細(xì)胞，易于貼壁生長(zhǎng)。電鏡見(jiàn)培養(yǎng)細(xì)胞相互接觸后，接觸面細(xì)小絨毛減少，變?yōu)檩^粗的“殘枝樣”突起，而位于多個(gè)細(xì)胞間的細(xì)胞隨著與其它細(xì)胞及培養(yǎng)面實(shí)際接觸面積的減少，逐漸變圓，最后整個(gè)細(xì)胞逐漸脫離培養(yǎng)面成為脫落細(xì)胞，漂浮于培養(yǎng)液中，凋亡小體少見(jiàn)。予β-NGF后見(jiàn)細(xì)胞集落、密度和圓形深染細(xì)胞增多，細(xì)胞表面絨毛、微絨毛和纖毛變粗、變長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)微絲、微管增多、增大、增粗，較對(duì)照組明顯。細(xì)胞爬片IHC示：MIAPaca-2細(xì)胞中β-NGF、TrK

6、A及P75NGFR均有明顯表達(dá)，以TrKA表達(dá)最為明顯。MMP-2、E-cadherin也有不等量表達(dá)、分布。MTT和FCM示：β-NGF可促進(jìn)MIAPaca-2細(xì)胞的增殖，主要是增加細(xì)胞周期中S期和G2/M期細(xì)胞的比例，而減少G0/G1期細(xì)胞的比例，各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高親和力受體TrKA抑制劑K252a則可抑制β-NGF對(duì)細(xì)胞的促增殖作用，各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組過(guò)河時(shí)間為(68.4

7、5±3.53)h，β-NGF組過(guò)河實(shí)驗(yàn)為(42.50±4.12)h，β-NGF組過(guò)河時(shí)間明顯縮短(P<0.01)。趨化侵襲實(shí)驗(yàn)：隨著外源性β-NGF濃度的增加，MIAPaca-2細(xì)胞的侵襲和趨化能力均明顯增強(qiáng)，組問(wèn)存在顯著性差異(P<0.05)。而K252a則呈濃度依賴性明顯抑制腫瘤細(xì)胞的趨化、侵襲能力，呈明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系。β-NGF可降低癌細(xì)胞間的黏附能力，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)遷移。成功建立了裸鼠皮下和原位移植瘤胰腺癌動(dòng)物模型，皮下移植瘤無(wú)臟器

8、轉(zhuǎn)移，原位移植瘤在4W、6W和8W時(shí)均可見(jiàn)PNI，幾率分別為50％、80％和60％，并可見(jiàn)多種臟器轉(zhuǎn)移。6W原位移植瘤組織壞死少見(jiàn)、結(jié)構(gòu)清晰。病理解剖見(jiàn)部分受侵神經(jīng)組織大量密集分布。IHC、RT-PCR、RealtimePCR、Westembolt、基因測(cè)序等方法檢測(cè)結(jié)果示，6wks原位移植瘤組織中β-NGF、TrKA和P75NGFR的mRNA、蛋白表達(dá)量明顯增加，而E-cadmRNA、蛋白表達(dá)較對(duì)照組織明顯降低。原位瘤細(xì)胞β-NGF、

9、TrKA、P75NGFR、E-cadherin、MMP-2陽(yáng)性表達(dá)，雙染見(jiàn)β-NGF和TrKA可同時(shí)表達(dá)，瘤細(xì)胞TrKA表達(dá)較多，神經(jīng)纖維β-NGF表達(dá)較多。瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)示表面的突起、微絨毛、纖毛明顯增多、變粗；細(xì)胞內(nèi)微絲、微管明顯變粗、變長(zhǎng)。尤以伴PNI之原位瘤細(xì)胞為甚。β-NGF和TrKA基因測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBIBlast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)β-NGF序列與Genbank中位于1P21-1p22.1的已知序列(AF411526)完全一致、Tr

10、KA與M23102完全一致。 結(jié)論：體內(nèi)、體外MIAPaCa-2細(xì)胞均同時(shí)表達(dá)β-NGF和TrKA，但以TrKA為主，說(shuō)明癌細(xì)胞在體內(nèi)、體外生物學(xué)功能一致性。神經(jīng)細(xì)胞也可同時(shí)表達(dá)β-NGF和TrKA，但以β-NGF為主。癌細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞TrkA、β-NGF同時(shí)雙相交互高表達(dá)，β-NGF和TrKA相互作用，通過(guò)信號(hào)傳遞，可能既可引起局部癌細(xì)胞增殖，也可引起癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)浸潤(rùn)。β-NGF可能通過(guò)促進(jìn)MMP-2/9表達(dá)、