UCP2在非小細胞肺癌中表達與缺氧關系的探討.pdf

1、目的與背景
　　解耦聯(lián)蛋白2（uncouplingprotein2，UCP2）屬于線粒體離子轉移蛋白，定位于線粒體內(nèi)膜上。其廣泛低表達于各種正常組織，但在病理狀態(tài)下高表達。UCP2在體內(nèi)可抑制腫瘤生長,但在腫瘤組織中可以保護腫瘤對抗放、化療的作用。目前，UCP2在體內(nèi)被激活途徑尚不清楚。缺氧是腫瘤中常見的微環(huán)境，在缺氧下UCP2的作用及通路亦不明確。本研究探討了UCP2在非小細胞肺癌中與缺氧的關系，UCP2在體內(nèi)激活的途徑，為腫瘤

2、的發(fā)生及治療的新思路作了探索。
　　材料與方法
　　1．收集83例I-Ⅲ期非小細胞肺癌病人切除標本，取正常肺組織、癌組織。按性別、年齡、病理類型、及是否淋巴結轉移分組，分析UCP2的表達與非小細胞肺癌臨床特點的相關性。以及UCP2與HIF-1a表達關系。
　　2．探討UCP2在腫瘤細胞內(nèi)激活途徑：體外使用100uM，150uM，200uMCOCl2誘導肺腺癌A549細胞缺氧。用Real-timePCR及Westernb

3、lot分析UCP2不同缺氧條件下RNA表達及蛋白水平。
　　3．體外構建PCDNA3.1-UCP2質(zhì)粒及SiRNA-UCP2小干擾RNA，轉染肺腺癌A549細胞系，用Real-timePCR及Westernblot分析、確定其上調(diào)還是抑制A549細胞中UCP2的表達，建立UCP2過表達或UCP2沉默的A549細胞。
　　4．探討UCP2在腫瘤細胞缺氧中的作用：1）流式細胞儀檢測A549細胞在不同缺氧條件下細胞凋亡情況，確定本

4、實驗最適缺氧條件。2）在最適的缺氧條件下通過調(diào)控UCP2的表達，用流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡情況，探討UCP2在腫瘤細胞缺氧條件下與凋亡的關系。3）檢測ROS、細胞色素C、Caspase-9，研究UCP2細胞缺氧凋亡通路。
　　研究結果
　　1．免疫組化分析83例非小細胞肺癌標本顯示：瘤組織中UCP2的表達主要定位于細胞漿中，呈黃色至棕黃色染色，表達率為：72.3％。在正常肺組織中，中未檢測到UCP2。為了解UCP2表達與臨

5、床特點的關系，按年齡、性別、病理分型、是否淋巴結轉移分組分析結果顯示：UCP2的表達與年齡（P=0.28）、性別（P=0.19）無關；鱗、腺癌間具有顯著差異（p=0.001）；同時，UCP2的表達量與淋巴結轉移有關（P=0.010）。
　　2．連續(xù)切片HIF-1a免疫組化發(fā)現(xiàn)：UCP2的表達存在區(qū)域性，其陽性區(qū)域與HIF-1a陽性區(qū)域一致。二者在表達量上存在關聯(lián)性。但在4例HIF-1a陽性標本未能檢測到UCP2的表達。且在同一標本

6、存在UCP2陽性而HIF-1a陰性的現(xiàn)象。
　　3．A549細胞在不同濃度COCl2誘導下，檢測HIF-1amRNA及蛋白水平，證實COCl2可以誘導出缺氧。在不同缺氧條件下，UCP2和HIF-1a在mRNA及蛋白水平表達隨缺氧程度而增加，結果顯示：UCP2在缺氧中mRNA較蛋白水平增加明顯；但是，在同樣的缺氧條件下，HIF-1a表達量較UCP2的表達量增加明顯。
　　4．經(jīng)脂質(zhì)體轉染A549細胞，Westernblot檢測

7、表明，PCDNA3.1-UCP2-A549較陰性對照細胞UCP2蛋白表達明顯增高。SiRNA-UCP2-A549較陰性對照細胞UCP2蛋白表達明顯下降。這個結果說明這兩種方法可以在A549中調(diào)控UCP2的表達。
　　5．流式細胞儀檢測顯示：A549細胞凋亡數(shù)與缺氧程度呈正比。A549細胞在CoCl2濃度大于150uM誘導缺氧條件下與正常氧狀態(tài)相比，細胞凋亡數(shù)量明顯增加，具有統(tǒng)計學差異(19.64±4.88VS12.2±5.88,P

8、<0.05）。我們選用150uMCoCl2作為以后缺氧實驗的條件，在此條件下，過表達UCP2的A549細胞較陰性對照組細胞凋亡減少(6.96±1.05VS15.98±2.22,P<0.001）；沉默UCP2的A549細胞較陰性對照組細胞凋亡明顯增多(24.3±1.55VS12.76±1.37,P<0.001）。提示UCP2可以抑制腫瘤細胞在缺氧狀態(tài)下凋亡。通過流式細胞儀檢測，在沉默UCP2細胞內(nèi)，ROS的量比陰性對照組細胞內(nèi)ROS的量明

9、顯增加(60.3±4.18VS51.11±2.22,P=0.006)。相反，過表達UCP2的細胞內(nèi)ROS量比陰性對照組細胞內(nèi)ROS量明顯減少(42.16±2.78VS52.92±2.63,P<0.001)。Westernblotting結果顯示：沉默UCP2蛋白的A549細胞胞漿中細胞色素C及Caspase蛋白條帶較空白對照細胞胞漿中細胞色素C及Caspase蛋白條帶增強。然而，UCP2過表達時，A549細胞胞漿中細胞色素C及Caspa

10、se蛋白條帶較空白對照細胞胞漿中細胞色素C及Caspase蛋白條帶減弱。
　　結論
　　1．通過免疫組化法檢測，UCP2的表達主要定位于細胞漿中，呈黃色至棕黃色染色。UCP2在非小細胞癌中表達的臨床特點：癌組織中高于正常肺組織；其表達量與年齡、性別無關，但與腫瘤類型及是否發(fā)生淋巴結轉移密切相關。UCP2有望成為判斷NSCLC轉移和預后的指標之一。
　　2．通過組織切片實驗發(fā)現(xiàn)：UCP2陽性表達區(qū)域與HIF-1a陽性表達

11、區(qū)域一致，提示：缺氧可能在人體內(nèi)激活UCP2的表達。
　　3．A549細胞中UCP2的表達量隨缺氧程度而增加。提示：缺氧導致UCP2的表達增加。
　　4．A549細胞凋亡數(shù)與缺氧程度呈正比，體外通過COCl2誘導A549缺氧最宜缺氧條件為150mMCOCl2培養(yǎng)24h。
　　5．通過PCDNA3.1-UCP2質(zhì)粒及SiRNA-UCP2小干擾RNA可以在調(diào)控A549細胞中UCP2的表達。
　　6．腫瘤細胞內(nèi)過表達U