血小板Sema4D鈣調蛋白結合基序的鑒定及其調控Sema4D切割的機制研究.pdf

1、神經導向因子Semaphorin4D(Sema4D；CD100)是首先在T淋巴細胞上發(fā)現的具有促進B細胞分化功能的I型跨膜糖蛋白，進一步的研究表明Sema4D通過其受體CD72/Plexin-B1/Plexin-B2參與免疫反應、神經生長、腫瘤血管新生、血栓形成以及骨生長等。Sema4D可以被金屬蛋白酶17（ADAM17）切割，產生具有生物活性的可溶性蛋白。然而，Sema4D切割和可溶性Sema4D生成的調控機制所知甚少。目前認為可能有

2、兩種機制：第一，切割酶的表達和活性的增強可導致Sema4D的切割；第二，“底物主導”的切割機制，Sema4D構象改變后可以更接近切割酶，導致自身被切割。本論文根據Sema4D的切割可能是“底物主導”（substrate-oriented）的設想，系統(tǒng)分析了Sema4D氨基酸序列和分子結構，發(fā)現Sema4D的胞內段近膜區(qū)含有一段18個氨基酸組成的序列（Arg762-Lys779），這段序列具有保守的極性氨基酸殘基，并且可以形成兩親性α螺旋

3、，這是鈣調蛋白結合的特征性結構。利用免疫共沉淀技術，我們證明在靜息血小板中Sema4D分子與鈣調蛋白結合，血小板活化后Sema4D-鈣調蛋白復合體解離,提示鈣調蛋白參與Sema4D切割調控。
　　為了探究Sema4D是否通過這段18個氨基酸組成的基序與鈣調蛋白結合，我們合成了 Sema4D鈣調蛋白結合基序的多肽，命名為Sema4D鈣調蛋白結合肽（Calmodulin-binding peptide of Sema4D, CBPS）

4、，以這段多肽作為一種工具來進一步研究 Sema4D-鈣調蛋白結合的分子機制，以及阻斷結合所產生的生物學效應。利用蛋白標記、結合實驗證明CBPS可與天然和重組Sema4D結合，其解離常數為165±40 nM，這與血小板表面其他受體與鈣調蛋白的解離常數類似。將CBPS多肽作為工具來研究Sema4D切割，首先要明確CBPS是否可以穿過細胞膜，利用流式細胞儀以及共聚焦顯微鏡技術，我們證實 CBPS多肽可穿過細胞膜，存在于血小板內部。功能研究證明

5、5μM CBPS處理血小板30秒即可誘導血小板Sema4D-鈣調蛋白復合體的解離，同時，我們觀察了CBPS對Sema4D分子切割的影響，結果顯示，CBPS誘導Sema4D切割并且呈現濃度、時間依賴性。而且，CBPS誘導的這種切割不依賴于血小板活化和ADAM17的活性增加。
　　鈣調蛋白在細胞內以游離形式或者結合形式存在，兩種形式之間保持一動態(tài)平衡。CBPS進入血小板內部，與鈣調蛋白結合，打破動態(tài)平衡，導致一些結合形式的鈣調蛋白轉變

6、為游離形式，誘導Sema4D分子切割，同時我們也檢測到CBPS可以誘導其他膜蛋白受體（如GPIbα、GPVI）切割，然而，我們的結果顯示，5μM的CBPS就可以誘導Sema4D分子切割，而誘導GPVI和GPIbα切割則分別需要10μM和20μM，說明CBPS對三種分子切割的敏感性不同，這也提示我們鈣調蛋白調控切割機制的普遍性與復雜性共存。利用鈣調蛋白抑制劑 W7進一步證明了鈣調蛋白調控Sema4D切割這一生物現象。
　　以上我們是

7、采用血小板為模型進行鈣調蛋白調控切割的研究，我們認為這種現象也存在于其他細胞中，而且之前有文獻表明在淋巴細胞中，Sema4D自發(fā)切割產生可溶性片段。因此，我們通過基因突變方法，構建了 Sema4D突變質粒，刪除Sema4D分子鈣調蛋白結合基序，從而阻止Sema4D與鈣調蛋白結合。將質粒轉染中國倉鼠卵巢細胞，發(fā)現當刪除鈣調蛋白結合基序后Sema4D分子的自發(fā)切割明顯增加。這一結果支持之前報道的自發(fā)切割現象。
　　綜上所述，我們的研究