藥物誘導大鼠骨髓間充質干細胞向成骨細胞轉化的實驗研究及鑒定.pdf

1、目的：骨髓組織中含有兩種干細胞成分即造血干細胞和骨髓間充質干細胞。骨髓中的間充質干細胞不僅能產(chǎn)生造血細胞的微環(huán)境，輔助骨髓造血，而且還可以分化成各種胚層細胞，它以無可比擬的優(yōu)越性成為組織工程種子細胞的理想來源。本實驗采用Percoll密度梯度離心、貼壁篩選法及單克隆培養(yǎng)法，分離、培養(yǎng)、擴增出高度同源性的大鼠骨髓間充質干細胞（MSCs），建立MSCs體外分離、培養(yǎng)體系，探討大鼠骨髓間充質干細胞的生物學特性，并將其向成骨細胞定向誘導分化為進

2、一步的研究其作為骨組織工程的種子細胞打下基礎。骨髓間充質干細胞（MSCs）位于骨髓的基質細胞系中，在體外可以通過貼壁培養(yǎng)加以分離，由于其分裂增殖能力強，可以分化為多種結締組織細胞，形成骨、軟骨、肌腱、肌肉、脂肪、神經(jīng)等，并易于被外源基因轉染并穩(wěn)定表達。
　　 現(xiàn)在臨床患者中以各種原因引起的骨組織缺損或不同疾病侵蝕所造成的骨損傷，醫(yī)務工作者急待有新的治療方法的出現(xiàn)，改善目前臨床上常用死骨摘除、假體置換等等方法治療，對一些患者來說，

3、這些療法損傷較大且療效不甚理想，并有一定的經(jīng)濟負擔，不少患者放棄手術而采取中藥保守治療。在重大的責任壓力面前，研究者們不斷研究探索，采用骨髓分離細胞加以純化，增殖培養(yǎng)等方法，對極少量的骨髓間充質干細胞進行擴增，藥物誘導，結果可得到大量較純的骨髓間充質干細胞來源的成骨細胞。為臨床開辟了治療骨缺損后新的、有效的治療方法。
　　 骨髓中MSCs含量雖然很少，約占骨髓內(nèi)單核細胞總數(shù)的1/104～1/105，并隨年齡增加而減少，但MSCs

4、取材方便，有強大的分化潛能，可以在體外擴增，由它誘導的組織細胞進行移植時不存在組織配型和免疫排斥反應。因此，在骨組織工程學中，骨髓間充質干細胞（MSCs）成為研究骨缺損和骨壞死修復的熱點。
　　 本實驗旨在通過研究建立大鼠骨髓間充質干細胞體外分離培養(yǎng)方法體系，探討其向成骨細胞分化的最佳誘導條件，為今后的進一步動物實驗以及未來用于人類骨科疾病的臨床治療奠定基礎。
　　 方法：大鼠斷頸處死，無菌條件下，取股骨和脛骨的骨髓腔內(nèi)

5、的骨髓，采用Percoll（1.073g/ml）密度梯度離心和貼壁篩選法分離出骨髓間充質干細胞作為原代細胞，將其置于37℃，飽和濕度5％ CO2的常規(guī)條件下培養(yǎng)，選擇P2代細胞，待進入對數(shù)生長期后用于實驗。
　　 1.MSCs原代細胞培養(yǎng)：SD大鼠，體重在70～80g左右，斷頸處死，在75％的乙醇中浸泡5分鐘，四肢固定于蠟盤上，碘酒消毒，剪開下腹部皮膚，暴露出股骨和脛骨，盡量剔除干凈骨膜和軟組織，剪開骨頭兩端，露出骨髓腔。用肝素

6、-Hanks混合液（1：9）沖洗骨髓腔，反復數(shù)次。收集此骨髓液按1：1的體積比加于密度為1.073g/ml的Percoll分離液上層。以2000轉/分鐘轉速離心20分鐘，吸取液面交接處的單個核細胞。用Hanks懸浮細胞，2000轉/分鐘離心10分鐘，反復2次。吸去上清液后用含20％FBS的DMEM懸浮細胞，調整細胞濃度為1×105/m，接種于25ml塑料培養(yǎng)瓶。每日鏡下觀察細胞生長情況。
　　 2.MSCs的鑒定：包括形態(tài)學觀察

7、，細胞周期的檢測，流式細胞術細胞表面分子的檢測（CD44、CD34），細胞增殖率檢測（細胞生長曲線），甲苯胺藍染色。
　　 3.誘導培養(yǎng)MSCs向成骨細胞分化：取P2代MSCs，按密度為5×105/ml接種于6孔板中，按加入誘導劑中地塞米松濃度不同（1×10-7mol/L和1×10-8mol/L）分為2個實驗組和1個常規(guī)培養(yǎng)的對照組進行培養(yǎng)，隔日換培養(yǎng)液一次，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。
　　 4.成骨誘導分化后

8、的鑒定：包括形態(tài)學觀察，Giemsa染色法，堿性磷酸酶（ALP）染色和活性測定，Ⅰ型膠原的免疫組織化學染色，茜素紅鈣節(jié)結染色。
　　 結果：1.骨髓間充質干細胞（MSCs）的培養(yǎng)與觀察原代MSCs細胞接種后2～3天，倒置顯微鏡下可見單個細胞貼壁生長，3天后首次換液，部分細胞形成集落，增殖迅速，成放射狀向周圍擴展。以后隔日換液一次，培養(yǎng)至12～14天，達到80％～90％融合，呈旋渦狀或束狀排列。而且位于培養(yǎng)瓶邊緣的細胞密集，長勢優(yōu)

9、于中央部位的細胞集落，即出現(xiàn)細胞邊聚現(xiàn)象；細胞呈紡錘形、梭形、多角形等，細胞間界限清晰，胞漿飽滿，胞核圓形，居中或偏于細胞一側，單個或多個核仁，生長期細胞分裂相多見。細胞傳代至4代后，細胞增長速度減慢、細胞體積增大，胞漿折光度減弱、開始出現(xiàn)小空泡，提示細胞老化。
　　 2.MSCs成骨誘導和細胞形態(tài)觀察 MSCs經(jīng)成骨誘導后，細胞形態(tài)由長梭形逐漸變?yōu)槎噙呅位蛉切?；胞漿豐富，并伸出多個細而短的突起于周圍細胞相連，胞核大而清晰，呈

10、圓形或卵圓形，1～3個核仁。細胞可復層生長，形成細胞結節(jié)甚至團塊狀。
　　 3.MSCs細胞周期的檢測取第2代MSCs，胰酶消化后制成細胞懸液，收集大約1×106個細胞，流式細胞儀檢測。G0/G1期的細胞為80.33％，G2期的細胞為2.62％，S期的細胞為16.95％，大部分細胞處于靜止期，只有少數(shù)細胞處于活躍的增殖期，符合干細胞的特征。
　　 4.MSCs表面分子的檢測流式細胞儀顯示CD44陽性率為96.37％，CD

11、34陽性率為5.8％，
　　 5.MSCs的生長曲線從生長曲線上可以看出MSCs生長潛伏期為1～3天，第3～4天進入對數(shù)增殖期，5～6天進入平臺期。
　　 6.甲苯胺藍染色后，MSCs細胞呈長梭形或三角型，胞漿呈藍色，胞核呈淡藍色，單個或2～3個核仁，清晰，呈深藍色
　　 7.MSCs成骨誘導后堿性磷酸酶（ALP）染色（Gomori鈣鈷法），成骨細胞胞質中呈現(xiàn)灰黑色顆?；驂K狀沉淀。
　　 8.MSCs成骨

12、誘導后鈣化結節(jié)染色（茜素紅法）后，肉眼見鈣化結節(jié)呈現(xiàn)不同的紅色團塊。
　　 9.MSCs成骨誘導后Ⅰ型膠原的免疫組織化學染色細胞核周圍呈黃褐色著色
　　 10. MSCs成骨誘導后Giemsa染色法，見胞漿豐富染成粉紅色，細胞核染成紫藍色，呈圓形或卵圓形，位于細胞中央或偏向一側，核仁明顯。
　　 11.誘導培養(yǎng)第3、6、9、12天的堿性磷酸酶活性（A405）測定，地塞米松濃度1×10-7組和1×10-8組與對照組

13、比較均有顯著性差異，p<0.05。兩種地塞米松濃度組間比較無顯著性差異。
　　 結論：1.用Percoll細胞分離液進行密度梯度離心可以獲得比較純的原代骨髓間充質干細胞。對骨髓間充質干細胞的鑒定可以通過形態(tài)學及生長特性的觀察；流式細胞儀檢測其細胞表面的分子標志；在一定條件下可以多向分化等。
　　 2.MSCs由兩種地塞米松濃度（1×10-7mol/L，10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50μg/ml維生素C和1×10-8m