脂多糖預(yù)處理減少心肌缺血再灌注損傷機(jī)制的研究.pdf

1、心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展，與多種機(jī)體自身內(nèi)在的免疫和炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路的激活有關(guān)。近年來(lái)的研究表明，NFκB激活在參與缺血再灌注損傷的免疫和炎癥發(fā)應(yīng)中起重要作用，而TOLL上樣受體介導(dǎo)的MyD88依賴(lài)途徑是細(xì)胞內(nèi)激活NFκB的主要信號(hào)通路。在YLRs介導(dǎo)的信號(hào)傳遞途徑中，MyD88是主要的連接蛋白，一但受體與配體結(jié)合，隨之結(jié)合MyD88，再結(jié)合IRAK， IRAK發(fā)生磷酸化。與IRAK結(jié)合的連接分子是TRAF6，TRAF6再激活NF

2、κB誘導(dǎo)激酶NIK，NIK激活I(lǐng)κB激酶IKK，后者可直接使NFκB的抑制性蛋白IκBa磷酸化，從而導(dǎo)致IκBa降解，激活NFκB。最新研究發(fā)現(xiàn)：刺激TLR4亦可激活PI3K/Akt信號(hào)途徑，一方面，Akt可能通過(guò)與IKK直接的作用調(diào)控NFκB的活性，另一方面，Akt是與細(xì)胞生存有關(guān)的重要調(diào)節(jié)因子，當(dāng)它激活時(shí)可以抗凋亡和促進(jìn)細(xì)胞生存。而大量的研究表明，PI3K/Akt信號(hào)途徑是體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)的一條重要的反饋和平衡機(jī)制，與MyD88所依

3、賴(lài)的NFκB激活通路存在“串講”現(xiàn)象。我們已經(jīng)觀察到小劑量脂多糖(LPS)預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生了保護(hù)作用，我們也觀察到LPS對(duì)TLR4的激活作用，因此，我們推測(cè)，LPS的這種保護(hù)機(jī)制是否與激活了體內(nèi)的PI3K/Akt信號(hào)途徑相關(guān)，并同時(shí)抑制了NFκB出的活性。本研究探討了小劑量LPS預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷可能的保護(hù)機(jī)制，觀察TLR4/PI3K/Akt以及TLR4/NFκB兩條信號(hào)途徑的激活，以及相互關(guān)系。 第一部分

4、 LPS預(yù)處理減輕心肌缺血再灌注損傷 目的：觀察小劑量LPS對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，檢測(cè)LPS預(yù)處理后心肌壞死面積和心肌細(xì)胞凋亡狀況。 材料和方法：年齡和體重相當(dāng)?shù)钠胀˙6小鼠，體重在25-30克，分為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組，假手術(shù)組，正常組。制作心肌缺血再灌注動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)組手術(shù)前1h給予LPS 250ug/kg腹腔注射，結(jié)扎左冠脈前降支約45分鐘，恢復(fù)灌注4h后，獲取心臟，檢測(cè)危險(xiǎn)區(qū)域(risk area)，與左心室

5、面積比較(AR/LV)，梗死區(qū)域與危險(xiǎn)區(qū)域的面積進(jìn)行比較(IR/AR)。用TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡狀況。 結(jié)果：小劑量LPS預(yù)處理后，心肌缺血再灌注損傷的壞死面積與危險(xiǎn)區(qū)域之比減少了約70.6％，與左心室面積之比減少了約64.9％。心肌細(xì)胞凋亡減少了約39.1％。 結(jié)論：小劑量LPS的預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷有顯著的保護(hù)作用。 第二部分 LPS預(yù)處理減少心肌缺血再灌注機(jī)制的研究。 目的：我們的研究已證

6、實(shí)了LPS提前1小時(shí)預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用，同時(shí)檢測(cè)這種保護(hù)作用是否與激活PI3K/Akt信號(hào)途徑、抑制NFκB的活性有關(guān)。此外還檢測(cè)心肌缺血再灌注損傷中，一些細(xì)胞因子的表達(dá)狀況。 材料和方法： kdakt小鼠即Akt無(wú)功能轉(zhuǎn)基因小鼠與普通B6小鼠，制作心肌缺血再灌注動(dòng)物模型，觀察梗死面積，方法同第一部分。取出心臟后，提取胞漿、胞核蛋白，用凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子的活力，用Western bl

7、ot分析蛋白表達(dá)狀況。檢測(cè)TLR4、Akt、GSK-3，IKK，IκB，VEGF165，Ang1，HMGB1，MIF，Bcl-2，HSP27在心肌中的表達(dá)狀況。 結(jié)果： LPS預(yù)處理對(duì)于kdakt小鼠即Akt無(wú)功能轉(zhuǎn)基因小鼠的保護(hù)作用消失，其梗死面積與不使用LPS預(yù)處理無(wú)差別。LPS預(yù)處理后，普通B6小鼠缺血再灌注損傷中的TLR4、VEGF165、Ang1、Bcl-2、HSP27的表達(dá)顯著升高；Akt、GSK-3的磷酸化程度顯著

8、升高；IKK無(wú)顯著性變化、IκB的降解程度顯著下降、HMGB1和MIF的表達(dá)顯著下調(diào)、NFκB的活力顯著下降。 結(jié)論：刺激興奮TLR4/PI3K/Akt信號(hào)途徑，并抑制NFκB的表達(dá)，是LPS預(yù)處理保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的重要機(jī)制，PI3K/Akt信號(hào)途徑是缺血再灌注損傷重要的反饋調(diào)節(jié)和平衡的經(jīng)路。同時(shí)，LSP預(yù)處理還能促進(jìn)VEGF165、Ang1、Bcl-2、HSP27在缺血再灌注損傷心肌中的表達(dá)，抑制HMGB1和MIF等有害

9、細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡。 第三部分 LPS預(yù)處理通過(guò)抑制NFκB的活性減少HMGB1的表達(dá) 目的：我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LPS預(yù)處理減少了NFκB的活性，同時(shí)也減少了HMGB1和MIF在胞漿中的表達(dá)。我們?cè)诩?xì)胞離體實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步檢測(cè)，明確是否由于抑制NFκB的活性而減少了HMGB1和MIF的表達(dá)。 材料和方法：大鼠心肌成肌細(xì)胞H9c2，分成兩部分，一部分在培養(yǎng)基中加入LPS50ng/ml，另一部分轉(zhuǎn)染攜帶功能缺陷的

10、IκB的腺病毒1×10<'10> pfu/ml，預(yù)處理24小時(shí)后，置于0.5％O<,2> 氧環(huán)境下12小時(shí)。用凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子的活力，用Western blot分析HMGBl和MIF蛋白表達(dá)。 結(jié)果：缺氧刺激了H9c2細(xì)胞漿中HMGB1和MIF的含量升高，在12小時(shí)達(dá)最高峰。LPS的預(yù)處理顯著降低了缺氧刺激的HMGB1含量以及NFκB活性，轉(zhuǎn)染攜帶功能缺陷的IκB的腺病毒后，結(jié)果相似，也顯著降低了缺氧刺激

11、的HMGB1含量以及NFκB活性。 結(jié)論： LPS預(yù)處理通過(guò)抑制了NFκB活性而減少胞漿中HMGB1的含量。 第四部分 VEGF165和Ang1抑制NFκB的活性，減少HMGB1的表達(dá) 目的：在以往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)血管生長(zhǎng)因子VEGF165和Ang1對(duì)缺血性心臟病的保護(hù)作用中，除了改善局部血管再生外，還存在對(duì)心肌細(xì)胞的直接保護(hù)作用。我們也發(fā)現(xiàn)LPS預(yù)處理升高了缺血再灌注心肌中VEGF165和Ang1含量。我們?cè)?/p>

12、細(xì)胞離體實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步檢測(cè)，觀察VEGF165和Ang1這種直接保護(hù)作用是否是通過(guò)抑制NFκB的活性，減少HMGB1的表達(dá)的。 材料和方法：大鼠心肌成肌細(xì)胞H9c2，轉(zhuǎn)染攜帶人VEHF165和Ang1的腺病毒100ul(1×10<'8>pfu/ml)24H，隨后過(guò)氧化氫50umol刺激12H，檢測(cè)HMGB1的胞漿含量和NFκB的活性。 結(jié)果： VEGF165和Ang1聯(lián)合使用能顯著減少心肌細(xì)胞胞漿中HMGB1的含量和NFκ

13、B的活性。 結(jié)論： VEGF165和Ang1通過(guò)抑制NFκB的活性，減少HMGB1的含量而對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生直接保護(hù)作用。 小結(jié) ①小劑量LPS1H預(yù)處理對(duì)缺血再灌注心肌損傷有顯著保護(hù)作用。 ②LPS刺激興奮TLR4/PI3K/Akt信號(hào)途徑，并抑制TLR4/NFκB信號(hào)途徑，是LPS預(yù)處理保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的重要機(jī)制。 ③LPS預(yù)處理通過(guò)抑制了NFκB活性，從而減少了胞漿中HMGB1的含量。