CFB-siRNA抑制實驗性大鼠脈絡膜新生血管的實驗研究.pdf

1、目的:年齡相關性黃斑變性(age-relatedmaculardegenerate-on，AMD)是導致55歲以后視力不可逆損害的主要原因之一，其分為干性AMD和濕性AMD。濕性AMD的主要特征是脈絡膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)，CNV可導致中心視力的突然減退。目前對于CNV的發(fā)生機制尚未十分明確，已上市用于CNV治療的藥物主要是針對已形成的CNV，其作用時效短且不能根治CNV。CNV的高

2、發(fā)生率、發(fā)生機制的不明確性、以及難以根治成為醫(yī)學的重大挑戰(zhàn)。研究表明炎癥反應在CNV中起到重要作用，補體旁路途經的激活所產生的膜攻擊復合物(menbraneattackcomples，MAC)在實驗性CNV的發(fā)生中起到決定性作用。補體旁路途徑中有一關鍵因子為B因子，前期實驗證明通過RNA干擾技術抑制旁路途徑中B因子的表達，可以有效地抑制大鼠CNV的發(fā)生?；|金屬蛋白酶家族(matrixmetalloproteinase，MMPS)可以降

3、解細胞外基質，有利于CNV穿過Bruch膜，研究發(fā)現發(fā)生CNV時血管內皮細胞和巨噬細胞分泌MMPs。已有數種MMPs已被證明存在于AMD患者的CNV中。MMP-13與軟組織退化性關節(jié)炎及多種癌癥的發(fā)生有關，具有極強的降解細胞外基質能力，其與激光誘導的大鼠CNV是否有關還不得而知。前期實驗中已成功構建CFB-siRNA，并通過體外及體內研究證明了CFB-siRNA抑制CNV及其相關生長因子如VEGF、PDGE等的確切性。前期實驗中未對CF

4、B-siRNA抑制MAC的沉積做成評價，本實驗將進一步完善CFB-siRNA抑制實驗性CNV的實驗研究，并進一步探討MMP-13與激光誘導的CNV之間的關系以及MAC的沉積是否能誘導MMP-13的分泌。
　　 方法:
　　 1.CFB-siRNA在體內轉染靶向性的實驗研究。
　　 1.18-10周健康棕色挪威(BrownNorway，BN)大鼠24只，隨機分為2組，每組12只。氪激光(波長647nm，光斑直徑20

5、0μm，功率260mW,曝光時間0.05s)圍繞視盤均勻光凝9個點，以見到有氣泡產生提示Bruch膜被擊穿為準建立大鼠CNV模型。
　　 1.2隨機分為實驗組、實驗對照組。實驗組與實驗對照組均予激光建立動物模型，實驗組通過尾靜脈注射75μgB因子siRNA，實驗對照組通過尾靜脈注射生理鹽水。注射方式:尾靜脈快速注射法;注藥時間:光凝后第2天、4天、6天。觀察時間為激光后3、5、7、14d。于14d時行熒光素眼底血管造影(FFA)

6、。
　　 1.3處死大鼠，摘除眼球取眼后段組織制作石蠟切片。選取激光斑點及其附近處組織做切片，免疫組織化學觀察C5b-9(MAC)的表達情況。
　　 1.4圖像分析與統(tǒng)計學處理。
　　 采用SPSS16.0軟件對所得數據進行分析，觀察CFB-siRNA抑制C5b-9(MAC)表達的情況。
　　 2.MMP-13表達與CNV形成關系的實驗研究。
　　 2.18-10周健康棕色挪威(BrownNorw

7、ay，BN)大鼠30只，分為實驗組、空白組。氪激光(波長647nm，光斑直徑200μm，功率260mW,曝光時間0.05s)圍繞視盤均勻光凝9-10個點，以見到有氣泡產生提示Bruch膜被擊穿為準建立大鼠CNV模型。
　　 2.2實驗組予激光建立CNV模型。觀察時間為激光后3、5、7、14d。實驗組與空白組觀察指標為RT-PCR及免疫組織化學觀察MMP-13的表達情況。
　　 2.3圖像分析與統(tǒng)計學處理。
　　

8、采用SPSS16.0軟件對所得數據進行統(tǒng)計學分析。
　　 3CNV形成過程中MAC的沉積能否誘導MMP-13表達的實驗研究。
　　 3.18-10周健康棕色挪威(BrownNorway，BN)大鼠24只分為實驗組與實驗對照組，均予激光建立CNV動物模型。實驗組予尾靜脈注射75μgB因子siRNA，實驗對照組通過尾靜脈注射生理鹽水。注藥時間:光凝后第2天、4天、6天。觀察時間為激光后3、5、7、14d。
　　 3.

9、2觀察指標為RT-PCR及免疫組織化學觀察MMP-13的變化（免疫組織化學材料來自實驗第一部分與第二部分）。
　　 3.3采用SPSS16.0軟件對所得數據進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果:
　　 1CFB-siRNA在體內轉染靶向性的實驗研究。
　　 1.1FFA表現為造影早期強熒光斑，晚期出現與視網膜血管無關的熒光素滲漏。
　　 1.2實驗組比實驗對照組CNV發(fā)生率明顯降低。
　　 1.3

10、免疫組織化學結果顯示:實驗對照組C5b-9(MAC)在第3天時即有沉積，到第5天時達高峰，以后逐漸減低。實驗組C5b-9(MAC)一直處于低表達狀態(tài)。兩組各時間點相比較MAC的沉積于光凝后第3、5、7天差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 2MMP-13表達與CNV形成關系的實驗研究。
　　 2.1免疫組織化學染色顯示MMP-13表達位于細胞漿與細胞核。在實驗組中MMP-13于光凝后第5天開始明顯增多，7天時達頂峰，以后至14天時

11、表達處于穩(wěn)定。在空白組中一直處于低表達。兩組各時間點相比較于光凝后第5、7、14天表達存在顯著差異。
　　 2.2RT-PCR結果顯示MMP-13在空白組處于低表達，在實驗組中MMP-13于光凝后第3天時表達即開始增加，5天時持續(xù)增加，7天達頂峰，以后趨于平穩(wěn)。兩組各時間點相比較于光凝后第3天開始差異即有統(tǒng)計學意義。
　　 3.CNV形成過程中MAC的沉積能否誘導MMP-13表達的實驗研究。
　　 3.1免疫組織

12、化學及RT-PCR結果均顯示實驗組與實驗對照組MMP-13表達情況基本一致。
　　 結論:
　　 1.尾靜脈注射高劑量CFB-SiRNA能夠有效抑制激光誘導大鼠CNV的生成，CFB-SiRNA能靶向性抑制實驗性CNV中C5b-9(MAC)的表達，同時也證明導致激光誘導的CNV中MAC沉積的途徑是補體旁路途徑。
　　 2.MMP-13與激光誘導的大鼠CNV的形成有一定相關性。
　　 3.抑制MAC的沉積不能