大黃對(duì)膿毒癥大鼠干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的:膿毒癥是對(duì)人類(lèi)健康、經(jīng)濟(jì)生活、社會(huì)生活造成嚴(yán)重威脅的疾病之一。眾多學(xué)者對(duì)膿毒癥所致多器官損傷的機(jī)制已有廣泛研究,如:肺臟、心臟、肝臟、腎臟、脾臟、腦等,但對(duì)于消化系統(tǒng)的鮮有報(bào)道。胃腸道不僅是食物消化吸收的場(chǎng)所,更是人體內(nèi)的細(xì)菌庫(kù),近些年逐漸認(rèn)識(shí)到在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中胃腸道所發(fā)揮的重要作用,小腸作為機(jī)體膿毒癥的始動(dòng)器官[1-2],更是成為新的治療靶點(diǎn)。二胺氧化酶(diamineoxidase,DAO)存在于哺乳動(dòng)物的粘膜和絨毛上層,

2、大部分存在于小腸粘膜絨毛,極少部分存在于子宮內(nèi)膜絨毛。是具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶,是反映小腸粘膜功能及結(jié)構(gòu)完整性的較為理想的指標(biāo)。通過(guò)測(cè)定血清和小腸組織中DAO活性變化,來(lái)反映小腸粘膜屏障的功能,尤其可在無(wú)創(chuàng)情況下測(cè)定血清DAO活性來(lái)反映腸道的損傷及其修復(fù)情況。大黃被認(rèn)為在治療全身炎癥反應(yīng)綜合癥(systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS)及多器官功能障礙綜合征(multipleorgandysfu

3、nctionsyndrome,MODS)等方面有明顯效果[3]。本研究旨在通過(guò)測(cè)定各組膿毒癥大鼠血清DAO水平、腸組織勻漿DAO水平及血清TNF-α來(lái)揭示大黃對(duì)膿毒癥大鼠發(fā)揮保護(hù)作用之機(jī)制、療效。以期指導(dǎo)臨床用藥,降低膿毒癥患者的死亡率、改善膿毒癥患者的預(yù)后、減少膿毒癥患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:成年、健康SD大鼠84只,購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證編號(hào)1303144),雌雄各半,按隨機(jī)數(shù)字法分為五組,分

4、別是Ⅰ空白組6只、Ⅱ假手術(shù)組6只(對(duì)照組)、Ⅲ盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)組24只、Ⅳ大黃治療組24只、Ⅴ烏司他丁治療組24只。又將Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組經(jīng)隨機(jī)數(shù)字表法分為四個(gè)時(shí)相組,盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)后6h、CLP后12h、CLP后24h、CLP后48h、每時(shí)相組6只。
　　 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:將各組大鼠于實(shí)驗(yàn)前分別稱重,并按大鼠編號(hào)分別記錄。大鼠盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)模型制備:實(shí)驗(yàn)室溫度控制在24～26℃,濕度在35～45％。將麻醉好的大鼠固

5、定于試驗(yàn)臺(tái)上,取大鼠仰臥位,75％酒精消毒腹部備皮區(qū),在無(wú)菌狀態(tài)下行腹部正中切口,約1.5cm,逐層打開(kāi)腹腔,探尋盲腸并將其拉出腹腔。小心游離盲腸末端腸系膜(一定要避免出血,否則極易縮短大鼠復(fù)蘇后的生存時(shí)間),將盲腸內(nèi)糞便輕輕推入直腸內(nèi)(同一批鼠,要保證盲腸結(jié)扎端內(nèi)糞便殘余量基本一致,確保實(shí)驗(yàn)大鼠膿毒癥的一致性),距離回盲部1.5cm處用4號(hào)絲線,避開(kāi)盲腸動(dòng)、靜脈,在血管弓內(nèi)側(cè)結(jié)扎(保證每只大鼠被結(jié)扎的盲腸長(zhǎng)度基本一致),結(jié)扎完畢仔細(xì)檢

6、查,保持腸道通路正常。以18號(hào)針頭在距離回盲部1cm處穿刺3次,可見(jiàn)少量腸內(nèi)容物流出。將盲腸還納入腹,逐層關(guān)腹。術(shù)畢,皮下注射生理鹽水3ml/100g補(bǔ)充體液丟失。術(shù)后暖燈照射下復(fù)蘇1.5～2h左右,大鼠蘇醒,可自由進(jìn)食飲水。以術(shù)后大鼠出現(xiàn)精神倦怠、少動(dòng)、寒戰(zhàn)、腹脹、眼角分泌物增多、豎毛,測(cè)肛溫＜34℃,處死后可見(jiàn)腹腔有血性滲液,盲腸腫脹、變黑、粘連,空腸腸管脹氣等表現(xiàn),確定膿毒癥造模成功。
　　 標(biāo)本采集與保存:采取眼球取血法

7、采血4ml,并將其置于普通塑料試管中,靜置約30min,待其自然凝固,析出血清,以3000轉(zhuǎn)/min離心10min,然后取上層血清約1.5ml,移至Eppendorf管中,-70℃冰箱保存待用。開(kāi)腹,距回盲部10cm處留取小腸組織5cm,將其縱行剖開(kāi),于冰生理鹽水漂洗,除去血液、腸道內(nèi)容物,濾紙吸干,稱取1g小腸組織,置于10ml的小燒杯,加入0.86％冰冷生理鹽水6ml剪碎組織后倒入玻璃勻漿器,再用3ml冰生理鹽水沖洗殘留組織,一起倒

8、入勻漿管中,充分研碎,以制成10％組織勻漿,置于4℃離心機(jī)中,以12000r/min離心12分鐘,然后用移液器取上層勻漿液約1.5ml,移至Eppendorf管中,-70℃冰箱保存待用。
　　 指標(biāo)檢測(cè):采用ELISA雙夾心抗體法,分別檢測(cè)每組大鼠四個(gè)時(shí)相組血清TNF-α、DAO及腸組織勻漿DAO含量。
　　 統(tǒng)計(jì)方法:所有數(shù)據(jù)采用(x)±s表示。用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、分析,以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1.血清二胺氧化酶(DAO)濃度分析
　　 模型組血清DAO含量總體高于假手術(shù)組(P＜0.05);模型組血清DAO含量造模后時(shí)間變量影響,24h組、48h組與6h組、12h組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01),于6h開(kāi)始升高,12h內(nèi)持續(xù)升高,于24h達(dá)高峰,48h維持在較高水平。
　　 大黃治療組、烏司他丁組6h、12h血清DAO濃度與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞

10、0.05);大黃治療組、烏司他丁組24h、48h組DAO濃度與模型組相比顯著降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。兩治療組各時(shí)間點(diǎn)血清二胺氧化酶(DAO)濃度相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2.腸勻漿DAO濃度分析
　　 各組各時(shí)間點(diǎn)腸勻漿二胺氧化酶(DAO)濃度相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 3.血清TNF-α濃度分析
　　 血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度在造模后6h達(dá)高峰(5

11、7.6±7.9),12h濃度降低(49.4±2.8),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),24h濃度明顯降低(23.3±3.1),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01),48h保持在較低水平(28.6±6.4)。大黃治療組、烏司他丁組各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α濃度與模型組相比,6h組明顯降低,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01),12h組仍明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),24h組、48h組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。大黃治療組與烏司他丁組各時(shí)間點(diǎn)血清

12、TNF-α濃度相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　 結(jié)論:1.大鼠盲腸結(jié)扎穿孔后血清DAO水平于6h開(kāi)始升高,12h內(nèi)持續(xù)升高,24h達(dá)高峰,48h維持在較高水平。
　　 2.大鼠盲腸結(jié)扎穿孔后血清TNF-α水平于6h達(dá)高峰,12h開(kāi)始回落,24h后明顯下降落,48h保持在一個(gè)較低的水平。
　　 3.大鼠盲腸結(jié)扎穿孔后腸勻漿DAO水平于各組均無(wú)變化。
　　 4.大黃及UTI可以顯著降低大鼠盲腸結(jié)扎穿孔