在線衍生高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定血清犬尿氨酸和色氨酸及其臨床應(yīng)用.pdf

1、目的：1.建立一種簡(jiǎn)單、快速的在線衍生高效液相色譜熒光法(HPLC-FLD)測(cè)定血清中的犬尿氨酸(KYN)。 2.建立同時(shí)檢測(cè)血清KYN和TRP的在線線衍生高效液相色譜熒光法。 3.初步探討測(cè)定血清KYN和TRP含量變化在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的臨床意義。 方法：1.血清標(biāo)本與等量5％(V/V)高氯酸溶液混合處理去除蛋白后離心取上清液20μl直接進(jìn)樣分析。用HpersilC8色譜柱(300mm×6.0mm i.d.，1

2、0μm)分離；流動(dòng)相為0.25 mol/L醋酸鋅及50 mmol/L醋酸溶液(含3％乙腈)，流速為1.5ml/min；熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為365nm和480nm。KYN經(jīng)流動(dòng)相中的醋酸鋅在線熒光衍生后，用HPLC-FLD進(jìn)行測(cè)定。KYN峰采用峰保留值比較法和疊加法定性分析，用外標(biāo)法測(cè)峰面積進(jìn)行定量分析。同時(shí)探討了檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相種類、流動(dòng)相中有機(jī)相的比例等因素對(duì)分離度和靈敏度的影響，考察了其它5種物質(zhì)對(duì)待測(cè)組分的可能干擾。

3、 2.在第一部分建立的方法的基礎(chǔ)上，調(diào)整檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，0-10 min熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為365nm和480nm，10 min后激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為254nm和404nm，實(shí)現(xiàn)KYN和TRP的同時(shí)測(cè)定，并對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。 3.測(cè)定類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者(n=110例)血清KYN和TRP、初步探討其含量變化在鑒別診斷、治療監(jiān)測(cè)、機(jī)制研究等方面的臨床意義。分析血清KYN、TRP以及KYN/

4、TRP比值與疾病活動(dòng)性分組、關(guān)節(jié)X線分期、關(guān)節(jié)功能分級(jí)、類風(fēng)濕因子(RF)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、血沉的相關(guān)性。 結(jié)果：1.血清標(biāo)本內(nèi)的KYN保留時(shí)間分別為8.1分鐘。KYN線性范圍為0.098～19.6μmol/L，最低檢測(cè)濃度為0.04μmol/L；回收率為90.8-96.2％，日內(nèi)CV為3.82％，日間為4.63％。苯丙氨酸(PHE)、酪氨酸(TYR)、犬尿喹啉酸(KYNA)、5-羥色胺(5-HT)和肌酐(Cr)在本文的色

5、譜條件下對(duì)KYN的測(cè)定均無(wú)干擾。 2.血清標(biāo)本的KYN和TRP均分離良好，保留時(shí)間分別為8.1和11.5分鐘。TRP的線性范圍為4.9～196μmol/L。最低檢測(cè)限為0.005μmol/L，回收率為92.6～106.9％，日內(nèi)CV為3.63％，日間為4.44％。上述5種物質(zhì)對(duì)待測(cè)組分KYN和TRP的測(cè)定均無(wú)干擾3.與正常對(duì)照組相比，RA組患者血清KYN含量顯著升高、TRP含量顯著降低；KYN/TRP比值與RF疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)

6、。 結(jié)論： 1.本文建立了在線衍生HPLC-FLD法測(cè)定血清KYN，方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確，適宜于臨床與科研工作。 2.在第一部分的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)建立了在線衍生高效液相色譜—熒光檢測(cè)法能同時(shí)測(cè)定KYN和TRP，且該方法的精密度，準(zhǔn)確性，回收率，抗干擾能力，線性范圍等指標(biāo)均符合診斷實(shí)驗(yàn)的要求，具有進(jìn)樣量少、快速、靈敏度高、準(zhǔn)確度較高、特異性好的特點(diǎn)。 3.RA患者體內(nèi)存在為嚴(yán)重的犬尿氨酸代謝紊亂，且KYN