蘋果[Malus domestica]DHAR基因cDNA全長(zhǎng)克隆及其植物表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、抗壞血酸作為一種重要的抗氧化劑，在植物細(xì)胞的酶促和非酶促反應(yīng)中都具有重要意義。為了維持抗壞血酸的抗氧化活力，它的再生就顯得尤為重要。在抵抗氧化脅迫的反應(yīng)中，抗壞血酸自身被氧化為單脫氫抗壞血酸，一部分單脫氫抗壞血酸在單脫氫抗壞血酸還原酶的催化作用下還原為抗壞血酸，另一部分單脫氫抗壞血酸的在歧化作用下被不成比例地還原為抗壞血酸或氧化為脫氫抗壞血酸。脫氫抗壞血酸還原酶以谷胱甘肽為底物，催化脫氫抗壞血酸還原為抗壞血酸，在循環(huán)利用抗壞血酸、保護(hù)細(xì)

2、胞組分抵御氧化損傷中發(fā)揮重要的作用。目前尚未見到從果樹中克隆到脫氫抗壞血酸還原酶基因全長(zhǎng)的報(bào)道。 本試驗(yàn)以嘎拉蘋果葉片為試材，克隆了脫氫抗壞血酸還原酶基因cDNA全長(zhǎng)并構(gòu)建其植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化其他植物、更好的研究其代謝途徑以及在抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中的作用奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1.比較了三種方法提取“皇家嘎拉”蘋果葉片總RNA的效果，發(fā)現(xiàn)改進(jìn)的十二烷基硫酸鈉-熱酚法可提出高質(zhì)量的RNA，且成本低廉，最

3、終選定此法用于實(shí)驗(yàn)。 2.根據(jù)GeneBank中已經(jīng)登陸的幾個(gè)編碼蘋果脫氫抗壞血酸還原酶基因cDNA片段的保守序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，運(yùn)用巢式PCR擴(kuò)增到一個(gè)中間片段，再根據(jù)此中間片段分別設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行3'-cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)和5'-cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)分別擴(kuò)增到蘋果脫氫抗壞血酸還原酶基因cDNA的3'端和5'端序列，最后獲得基因cDNA全長(zhǎng)。序列包括的最大開放閱讀框編碼314個(gè)氨基酸；序列同源性分析表明蘋果脫氫抗壞血酸還