RNA干擾抑制肝星狀細胞CTGF表達的實驗研究.pdf

1、背景與目的：慢性肝病(主要是慢性病毒性肝炎)是我國常見病之一，其重要病理基礎是肝纖維化，肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的共同病理基礎，如能阻斷、減輕乃至逆轉肝纖維化，就能在很大程度上改善肝病的預后，因而這就成為肝病治療學的一個重大課題。肝纖維化顯著特征是肝臟細胞外基質(ECM)合成和降解失衡最終引起ECM過渡沉積所致，肝星狀細胞(HSC)是肝纖維化時ECM過多產(chǎn)生和異常沉積的主要細胞來源，在肝纖維化形成過程中，HSC受細胞因子、基質

2、成分改變和氧化物應激而激活，細胞因子網(wǎng)絡始終是人們的研究熱點，其中轉化生長因子β 1(TGF-β<,1>)是目前已知最強的促肝纖維化的細胞因子，而且是肝纖維化形成過程中重要的始動刺激因子之一。用反義寡核苷酸或核心蛋白酶抑制TGF-β 1的過度表達，可改善實驗性肝纖維化動物模型的纖維化程度。但是由于TGF-β 1作用的靶細胞種類繁多、生物學效應復雜，TGF-β 1的受體存在于大多數(shù)細胞中，因此完全阻斷其表達或抑制其活性后果難以預料。有研究

3、表明，敲除TGF-β 1基因的小鼠因失去對炎癥的抑制，出生后很快死于嚴重的全身性炎癥反應。結締組織生長因子(CTGF)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種在器官纖維化病變中起中心作用的細胞因子，CTGF有可能是TGF-β 1致纖維化作用的直接下游效應介質；在創(chuàng)傷修復或纖維化過程中，CTGF是一種特異性更強的、可選擇性地干預結締組織形成的細胞因子，阻斷其表達可能是較特異、較有效的治療纖維化的方法，目前CTGF已成為可能替代TGF-β l治療纖維化疾病的靶細

4、胞因子。RNA干擾是目前最有效的基因沉默技術，能特異性抑制靶基因的轉錄，進而下調相應蛋白水平及功能。本研究應用免疫組化研究慢性乙型肝炎病人肝組織中CTGF的表達，探討CTGF與TGF-β1及肝纖維化的關系；構建3條針對CTGF的短發(fā)夾RNA(shRNA)，通過轉染肝星狀細胞后篩選出有效抑制CTGF表達的序列；并以CrGF為靶基因進行RNA干擾，研究其對肝星狀細胞TGF-β1、CTGF基因及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、透明質酸(HA)、層粘連蛋

5、白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CIV)等細胞外基質表達的影響，進一步探討CTGF在肝纖維化的作用及肝纖維化基因治療的可行陛。 結論： 1慢性乙型肝炎肝組織高度表達CTGF，與TGF-β1在肝內表達的增強程度呈正相關，并與病理上肝纖維化程度平行，與血清中細胞外基質水平呈正相關，提示CTGF與TGF-β1在肝纖維化時可能是相伴表達，作用上具有協(xié)同性；CTGF、TGF-β1對肝纖維化的形成與發(fā)展具有促進作用；

6、 2利用含U6啟動子及增強綠色熒光蛋白(EGFP)的質粒載體pEGFP可成功構建CTGF的shRNA干擾重組體，將構建成功的3組pEGFP—CTGFshRNA轉染肝星狀細胞后，其中兩組能高效抑制CTGF的表達：3 CTGF可能為TGF－β1發(fā)揮纖維化作用的下游介質； 4 pEGFP—CTGFshRNA能高效抑制肝星狀細胞中CTGF及細胞外基質的表達；CTGFshRNA介導的RNA干擾有望對慢性肝病所致肝纖維化具有治療潛力。