CXCL10基因與奶牛乳腺炎易感性-抗性相關功能性分子標記的研究.pdf

1、奶牛乳腺炎是一種常見的癥狀之一，受遺傳、環(huán)境等多種因素的控制，具有復雜性、多樣性及難愈性等特點，在其發(fā)生過程中有多種免疫相關基因參與。CXCL10屬于CXC趨化因子超家族的非ELR類，參與多種自身免疫性疾病。CXCL10在中性粒細胞，樹突細胞，單核細胞，上皮細胞，內皮細胞，纖維細胞等細胞表達，主要介導Thl型炎性反應，趨化趨化白細胞向炎癥部位聚集，可加強Thl反應的進程，破壞Th2反應的進程。借助分子生物學手段，對此基因從啟動子、miR

2、NA以及SNP等水平上，篩選可用于乳腺炎抗性/易感性的功能性SNPs，并探索基于這些功能性SNPs的分子調控機理。主要研究結果分述如下：
　　1.CXCL10基因的表達
　　利用平板稀釋計數(shù)法培養(yǎng)標準菌（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌），并分別計算其單位體積中活菌的個數(shù)（CFU）。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別以與RAW264.7細胞的倍數(shù)為：5、15、25、35、45、55和65，感染細胞1h。提取細胞中的RNA，進行熒光定量P

3、CR。通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，無論高濃度還是低濃度菌液感染，CXCL10 mRNA的表達量均增加，并且其表達量隨著菌液濃度的增加而升高。同時提取健康（n=5）和患有乳腺炎（n=5）牛靜脈血中的中性粒細胞，再提取RNA，進行熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)患有乳腺炎個體中CXCL10 mRNA的表達量顯著高于健康個體(P<0.05），表明CXCL10參與乳腺炎的發(fā)生過程，并在免疫過程中發(fā)揮重要的作用。
　　2.CXCL10基因核心啟動子活性分析

4、及功能SNPs的鑒定
　　首先利用在線軟件Genomatix預測基因CXCL10的啟動子區(qū)（g.-602～g.+102），然后將不同長度的啟動子片段（pGL3-1183，pGL3-958，pGL3-669和pGL3-377）構建到pGL3-Basic熒光素酶報告表達載體，經過瞬時轉染和雙熒光素酶活性測定，鑒定了CXCL10基因核心啟動子區(qū)位于g.-377～g.-1。對核心啟動子區(qū)域進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在許多轉錄因子結合

5、位點，如OCT1，E2F和HNF1等，這些轉錄因子可能在CXCL10基因轉錄過程中發(fā)揮著至關重要的作用。PCR擴增和序列比對后發(fā)現(xiàn)CXCL10基因核心啟動子區(qū)域存在2個完全連鎖的SNPs（g.-324 C>A和 g.-163 C>T），并也通過載體構建，瞬時轉染和雙熒光素酶活性測定發(fā)現(xiàn)突變型的啟動子活性顯著高于野生型（P<0.05）。軟件分析發(fā)現(xiàn)野生型增加了HNF1轉錄因子結合位點。對SNP（g.-324 C>A和 g.-163 C>T

6、）進行基因分型，并將其和SCS進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)該位點的突變型型個體具有較低的SCS。
　　3.CXCL10基因3’UTR和bta-miR-339相關性研究
　　利用PCR和序列比對的方法發(fā)現(xiàn)在CXCL10基因3’UTR區(qū)域存在一個SNP（g.+1642 A>G）。通過RNA hybrid和RNA22靶標預測軟件發(fā)現(xiàn)bta-miR-339可以結合，且發(fā)現(xiàn)bta-miR-339對CXCL10基因3’UTR區(qū)野生型和突變型的結合

7、能力存在明顯不同，對此SNP進行關聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)突變型（GG）具有較低的體細胞評分（SCS）（P<0.05）。將含有野生（AA）基因型和突變（GG）基因型的3’UTR中的355bp片段分別連接到PMIR-ReportTM Luciferase表達載體中，和bta-miR-339真核表達載體共轉染293T細胞。通過雙熒光素酶表達量分析，發(fā)現(xiàn)突變（GG）基因型顯著降低了bta-miR-339與CXCL10基因3’UTR區(qū)域的結合能力，同時發(fā)現(xiàn)

8、bta-miR-339可以降低CXCL10基因的表達。提取分別具有GG、AG和AA基因型個體乳腺組織中的總RNA，通過RT-PCR和RT-qPCR發(fā)現(xiàn)基因型AA個體中CXCL10 mRNA的表達量顯著低于其他基因型（P<0.05）。對SNP g.+1642 A>G進行基因分型，并將其和SCS進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)該位點的AA型個體具有較低的SCS。同時，本研究將CXCL10基因核心啟動子區(qū)和3’UTR區(qū)域的SNPs進行單倍型組合關聯(lián)分析，發(fā)

9、現(xiàn)H1H1，H2H4和H3H4單倍型組合相比于其它單倍型組合表現(xiàn)出較低的SCS（P<0.05）。
　　綜上所述，本研究選取CXCL10作為奶牛乳腺炎抗性候選基因，應用PCR和PCR-RFLP手段，進行目標基因及調控元件的克隆、SNP篩查及相關性分析，篩選到顯著影響奶牛乳腺炎的分子標記。應用生物信息學預測了目標基因的啟動子區(qū)及靶標miRNA，并通過細胞水平的轉染實驗，初步證實了新發(fā)現(xiàn)的分子標記的作用機理，為奶牛乳腺炎抗性的分子標記輔