DN大鼠腎內小動脈早期骨基質蛋白的表達及非洛地平對其作用的實驗研究.pdf

1、目的:糖尿病(diabetes mellitus，DM，)的血管病變是DM的主要并發(fā)癥，其大血管病變性質為動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)，主要累及主動脈、冠狀動脈等大血管。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是DM的重要并發(fā)癥，其發(fā)生、發(fā)展與糖尿病微血管損害有關。近年來發(fā)現血管鈣化是進展性．AS的普遍特征，是糖尿病患者發(fā)生心血管事件的重要預測因素。已有的研究表明DM患者較非DM患者更易發(fā)生血

2、管鈣化，而糖尿病伴發(fā)腎病者血管鈣化更為普遍和嚴重。由于目前對DM血管鈣化的實驗研究多集中于冠狀動脈、腎動脈等大動脈，對臟器內(如腎臟內)的小血管改變知之甚少。因此我們建立了鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導的糖尿病動物模型，擬采用免疫組化、原位雜交及實時熒光定量PCR(real time polymerase chain reaction，Real-TimePCR)等方法，多時點動態(tài)觀察糖尿病腎病腎內小動脈上與血管鈣化密

3、切相關的骨基質蛋白如核結合因子α亞單位1(core-binding factor a<,1>，Cbfa1)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、骨鈣素(osteocalcin，OC)等的表達變化。旨在研究這些骨基質蛋白在腎臟中的變化規(guī)律，了解腎內小動脈有無血管鈣化的發(fā)生，以及它們的改變是否參與了糖尿病腎臟的發(fā)生發(fā)展。同時觀察長效非洛地平這一鈣離子拮抗劑是否對DM的血管鈣化有改善作用。 方法:雄性成年SD大鼠，標準

4、化喂養(yǎng)。、設對照組、糖尿病組和非洛地平三組，每組4、8、12、16、24周5個觀察點，每時點6-7只鼠。 糖尿病組和非洛地平組采用STZ腹腔注射造模。造模成功后，干預組予長效非洛地平10mg/kg體重灌胃，每日一次。處死前留血、尿備測常規(guī)生化指標。腎臟石臘切片普通病理及茜素紅染色觀察腎內小動脈鈣鹽沉積情況。免疫組化半定量分析Cbfa1，OC，OPG蛋白水平的表達，mRNA原位雜交檢測Cbfa1，OC，OPG mRNA在腎內的定位

5、和表達變化。采用Real-Time PCR檢測腎臟OC及OPG mRNA表達并分析各指標間相關性。 結果:(1)免疫組化顯示。DN組各時點腎小球、腎小管均有Cbfa1的弱陽性表達，自第8周起，腎內小動脈中膜上Cbfa1表達逐漸增多，以第24周時表達最明顯。原位雜交結果提示Cbfa1mRNA表達部位與Cbfa1蛋白表達部位一致，表達量自第8周開始升高，以后隨病程進展表達逐漸上調，在24周時表達達峰值。而腎小球及腎小管、腎間質內表達

6、較弱，且隨時間進展變化不大。正常組有Cbfa1蛋白和mRNA的弱陽性表達，各時間點間無差異。(2)免疫組化示DN組第4-12周時腎臟未見OC的明確表達。第16周-24周時，可見在腎內小動脈上有OC的弱陽性表達。原位雜交示DN組第4～8周時腎內小動脈上無OCmRNA表達，第12周時出現OC mRNA的弱表達，第16-24周時表達進一步增強，表達部位與蛋白表達一致，腎小球及腎小管上無表達。Real-Time PCR結果提示DN組大鼠腎組織第

7、4～12周無OC mRNA的表達，第16周開始出現OC mRNA的表達，第24周時亦有表達，兩時間點無顯著差異。正常組腎組織未檢測到OC蛋白及mRNA表達。(3)OPG免疫組化提示DN組第4周時腎內小動脈上有OPG的弱陽性表達，自第8周時表達增多，12周時達峰值，第16周時表達開始下降，24周時更低。OPG原位雜交結果顯示OPG蛋白與mRNA表達部位一致，DN組第4周時腎內小血管上OPG mRNA表達較弱，第8周起表達逐漸增強，12周時

8、表達達峰值，第16周時表達開始下調，24周時進一步降低。Real-Time PCR結果示DN組不同時點OPG mRNA表達存在差異，第8周OPG mRNA表達開始上調，以12周表達最強，16周后表達逐漸下調，24周時更低。正常組腎組織有OPG蛋白和mRNA的弱表達，各時點無顯著性差異。(4)Cbfa1，OPG, OC的表達變化與血磷、血脂、腎功及尿蛋白呈正相關，三者間Cbfa1與OPG和OC相關性較好， OPG與OC呈正相關。(5)給予

9、非洛地平干預后，對血糖、血脂、血鈣磷及尿蛋白無明顯改善，對腎組織病理改變、鈣鹽沉積及Cbfa1，OC的表達無明顯改善。僅OPG的免疫組化和mRNA原位雜交、Real-Time PCR提示在16-24周時，非洛地平干預組OPG表達高于DN組。(6)腎組織茜素紅染色結果示正常組各時間點腎組織及腎內小動脈無鈣化，糖尿病組及非洛地平組在第16-24周時腎內小動脈存在輕一中度鈣化。 結論:(1) 糖尿病腎病腎內小動脈發(fā)生鈣鹽沉積前即已有C

10、bfa1，OC及OPG等骨基質蛋白的表達。(2)Cbfa1在糖尿病腎病腎內小動脈上表達持續(xù)上調，其后出現其下游蛋白OC的表達，并最終出現鈣鹽沉積，提示Cbfa1是糖尿病血管鈣化的重要轉錄因子，也是血管鈣化的早期生物學標志。(3)OPG在糖尿病腎臟早期表達上調，后期表達下調。早期表達上調可能為機體代償性的保護機制所致，后期下調與促鈣化因素如高血磷、高血脂的增強有關。(4)Cbfa1，OC及OPG的表達改變與尿蛋白增高、腎功能下降及血磷升高