中國NSCLC人群EGFR基因突變特點及EGFR-TKI作用機理研究.pdf

1、肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，我國2000年世界人口調(diào)整肺癌男性發(fā)病率為38.46/10萬，死亡率為33.21/10萬。女性調(diào)整發(fā)病率為15.70/10萬，死亡率為13.45/10萬，居各類惡性腫瘤死亡率首位。盡管近年來化療、放療有了長足的進步，但肺癌總的長期生存率并未得到明顯提高。當肺癌被確診時，65％屬于晚期，失去了手術機會，早期患者手術后需要接受輔助化療，術后幾年內(nèi)很多患者也會出現(xiàn)復發(fā)和轉移，因此幾乎所有的

2、非小細胞肺癌患者均需要進行輔助化療或者姑息化療?；熓悄壳翱梢钥刂七h處轉移的主要治療方法，但其緩解率低，臨床試驗顯示第三代化療藥物作為一線化療的有效率約為30～40％，二線化療的有效率僅有10％，且?guī)缀跛谢颊咦罱K將出現(xiàn)新的轉移病灶，因此發(fā)展新的治療方法成為研究的熱點。 近年來，隨著對于腫瘤細胞信號傳導途徑的研究不斷深入，人們對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)及轉移的分子機制認識越來越深入，針對腫瘤細胞信號傳導通路特異性分子靶點抗腫瘤治療

3、新方法，具有針對腫瘤治療特異性強的優(yōu)點，效果顯著，是腫瘤治療中甚具前景的方法。在非小細胞肺癌中EGFR的研究最為深入。 臨床上EGFR-TKI通過與ATP競爭EGFR胞內(nèi)區(qū)激酶催化位點，阻斷EGFR激酶活性。吉非替尼(Gefitinib，IressaTM)是一種特異性的EGFR酪氨酸激酶抑制劑，通過競爭性地抑制ATP與受體胞內(nèi)區(qū)結合，從而抑制酪氨酸激酶活化，阻斷EGFR的傳導通路，達到抗腫瘤治療的目的。 臨床試驗結果顯示

4、吉非替尼的療效在不同的人群中差異較大，日本患者和歐洲患者中有效率分別為27.5％和10.4％。2004年，研究報道發(fā)現(xiàn)EGFR基因18、19、21外顯子突變的NSCLC患者對吉非替尼的療效較好，而這種突變多見于東亞人種、女性、非吸煙者、腺癌的患者。但在臨床中卻顯示部分EGFR基因野生型的患者同樣對吉非替尼治療療效較好，也有研究結果提示除了EGFR突變，EGFR-TKI治療的療效還與EGFR基因的拷貝數(shù)有關。因此影響吉非替尼療效及預后的原

5、因尚不明確。 本研究通過檢測對中國NSCLC患者EGFR基因突變的情況，試圖闡明突變與臨床之間的關系，探討EGFR基因突變對。EGFR-TKI治療療效和預后的預測價值；通過原代培養(yǎng)的方法建立EGFR基因野生型EGFR高拷貝數(shù)的肺癌細胞系并對其進行鑒定；通過觀察吉非替尼對該肺癌細胞系EGFR下游信號通路分子表達的影響，探討EGFR-TKI藥物對EGFR基因野生型EGFR高拷貝數(shù)的肺癌細胞系生長及下游信號傳導的影響。 第1章

6、 NSCLC患者EGFR基因突變的檢測與臨床意義 材料與方法 1、病例選擇： 研究包括從2002年至2005年期間在廣東省人民醫(yī)院接受手術的144例非小細胞肺癌患者，所有患者均簽署了知情同意書，手術切除的腫瘤組織立刻置于液氮中，然后保存于-80℃。其中27例患者在疾病出現(xiàn)進展，二線化療失敗后接受了吉非替尼250mg口服／天治療，直至疾病再次進展或出現(xiàn)不可耐受的毒副作用，患者在治療后4周接受胸片或CT檢查評價

7、療效，以后每3個月復查一次，療效評價按照RECIST標準。組織病理學分型按照WHO標準。 2、基因組DNA的提取： 采用Trizol一步法提取腫瘤組織的的RNA和DNA。 3、PCR擴增EGFR基因與測序： 采用巢式PCR擴增EGFR基因18、19、21外顯子，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后回收純化PCR產(chǎn)物，BigDye標記測序序列后上機測序。 4、統(tǒng)計方法： 以P＜0.05作為有顯

8、著性差異的標準。不同組間突變率的差異采用x2檢驗或者Fisher精確概率檢驗。多因素分析采用logistic回歸模型進行檢驗。疾病進展時間比較采用Kaplan-Meier檢驗。統(tǒng)計分析采用SPSS軟件進行。 結果 在27例接受吉非替尼治療的患者(20例腺癌、3例肺泡細胞癌、2例鱗癌、2例大細胞癌)中，總的有效率(CR+PR)為48.1％(13/27)；男性和女性分別為43.8％(7.16)和54.5％(6/11)，p

9、=0.436；非吸煙者和吸煙者分別為60％(9/15)和33.3％(4/12)，p=0.090；腺癌和非腺癌分別為56.5％(12/23)和O％(0/4)，p=0.057，EGFR野生型和突變型患者疾病控制率分別為36.4％(4/11)和56.3％(9/16)，p=0.267。男性和女性的中位TTP沒有顯著差異(16個月VS.13個月，p=0.411)，不同吸煙狀況的患者中位TTP沒有顯著差異(14個月vs．11個月，p=0.714)，

10、EGFR基因野生型和突變型患者的中位TTP也沒有顯著差異(14個月VS．13個月，p=0.906)。 第2章肺癌細胞系的建立與鑒定及EGFR功能相關檢測 材料與方法 1、腫瘤細胞的分離培養(yǎng)： 分別采用從腫瘤組織中和從胸腹水中分離培養(yǎng)腫瘤細胞，從腫瘤組織中分離培養(yǎng)腫瘤細胞采用酶消化法分離細胞，分離后濾網(wǎng)過濾后接種，從胸腹水中分離培養(yǎng)腫瘤細胞則采用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞以減少間皮細胞的干擾。

11、2、腫瘤細胞系的鑒定： 當腫瘤細胞系傳代超過60代后對其生長特性進行了鑒定，包括：細胞生長曲線的繪制，染色體分析，流式細胞儀檢測細胞周期，軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗，動物接種實驗。 此外采用巢式PCR擴增、瓊脂凝膠電泳純化后直接測序?qū)δ[瘤細胞系EGFR基因突變進行檢測，利用FISH檢測了 EGFR基因拷貝數(shù)。 結果 腫瘤細胞系的鑒定：細胞生長曲線分析顯示細胞倍增時間為27.1小時；細胞

12、染色體分析表明染色體數(shù)量為66～78，并具異常染色體核型；流式細胞儀檢測腫瘤細胞周期分布為G1期占69.05％，G2期占11.32％，S期占19.63％；軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成率為27.3％。動物接種后第7天腫瘤開始形成。 腫瘤細胞的測序顯示3株腫瘤細胞系EGFR基因18、19和21外顯子均為野生型。EGFR基因拷貝數(shù)FISH檢測結果提示3株細胞系EGFR基因?qū)儆谄胶舛啾扼w型。其中2例患者接受EGFR-TKI治療療效較好。

13、 第3章 EGFR-TKl對肺癌細胞EGFR及其下游信號分子表達的影響 材料與方法： 采用MTT法檢測吉非替尼對腫瘤細胞系的殺傷，確定IC50的范圍；通過在細胞生長環(huán)境中加入適量吉非替尼阻斷細胞EGFR信號通路后，比較腫瘤細胞生長的變化；采用Trizol一部法提取腫瘤細胞的RNA后，利用Real-Time PCR檢測EGFR、raS及其下游信號通路MAPK、P13K／AKt重要分子表達的變化。對不同基因

14、的擴增效率進行檢測后，采用2-△△Ct法比較基因表達的差異。 結果 MTT法結果顯示吉非替尼在低濃度時即可對腫瘤細胞系的生長產(chǎn)生抑制，而IC50在4μM左右。 腫瘤生長環(huán)境中加入吉非替尼后，細胞的生長受到了明顯的抑制，活力顯著下降，細胞出現(xiàn)死亡。 基因擴增效率的測定顯示，幾個基因與內(nèi)參β-actin相比擴增效率一致，可以應用2-△△Ct法比較基因表達的差異。 結論

15、 1．對于中國NSCLC患者，EGFR基因突變的預測因子主要是病理類型和吸煙狀況，性別并不能預測患者的EGFR突變情況； 2．腺癌、女性、非吸煙患者、EGFR突變型患者接受吉非替尼治療的療效較好； 3．吉非替尼對中國肺癌患者有效率為48.1％，高于中國人群EGFR基因突變 率的27.8％，提示存在影響吉非替尼療效的其它因素。 4．胸腹水中提取腫瘤細胞進行原代培養(yǎng)可以作為腫瘤細胞原代培養(yǎng)的一條重要途徑； 5

16、．細胞系EGFR基因野生型細胞系可以表現(xiàn)為EGFlR高拷貝數(shù)型，EGFR基因突變和EGFR基因的拷貝數(shù)增加之間并無一致性。 6．EGFR基因野生型但拷貝數(shù)增高的患者接受EGFR-TKI可以有較好的療效。 7．吉非替尼對原代培養(yǎng)細胞系的IC50為4gM。 8．吉非替尼在低濃度下對EGFR野生型而EGFR高拷貝數(shù)的肺癌細胞具有較強的殺傷作用； 9．吉非替尼對于EGFR野生型而EGFR高拷貝數(shù)的肺癌細胞的EGF

17、R和RAS基因表達無明顯影響； 10．吉非替尼對EGFR高拷貝數(shù)肺癌細胞的MAPK、P13K／Akt信號通路有顯著的抑制作用，和未抑制相比，MAPK為0.529倍，P13K為0.148倍，Akt為0.195倍。 11．EGFR基因高拷貝數(shù)與EGFR-TKI治療療效之間可能存在一定關系。 創(chuàng)新點 1、本研究大規(guī)模的檢NT中國NSCLC患者EGFR基因突變的分布情況，并提出性別并不能預測患者的EGFR突變情況