食管鱗狀細(xì)胞癌的分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究.pdf

1、本研究目的是尋找、定位與ESCC相關(guān)的擴(kuò)增的癌基因以及缺失的抑癌基因，并探討他們?cè)贓SCC發(fā)病過(guò)程中的作用及可能的機(jī)制。首先，我們采用CGH對(duì)ESCC進(jìn)行全基因組掃描，鎖定高頻染色體擴(kuò)增與缺失區(qū)段；進(jìn)一步用FISH和免疫組化的方法在含大宗病例的組織芯片上，篩選和驗(yàn)證與ESCC有關(guān)的擴(kuò)增的癌基因和缺失的抑癌基因。再結(jié)合臨床病理資料，力圖揭示ESCC的某些分子特征，為全面和深入認(rèn)識(shí)ESCC分子細(xì)胞遺傳學(xué)致癌機(jī)制，提供研究基礎(chǔ)。 本文

2、研究分為4部分： 一、比較基因組雜交技術(shù)檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌分子遺傳學(xué)改變 收集31例新鮮ESCC組織，包括癌組織和癌旁正常食管粘膜組織。提取全基因組DNA，采用缺口平移法，分別標(biāo)記以光譜綠dUTP和光譜紅dUTP，制備成探針；與正常人的分裂中期染色體雜交；熒光顯微鏡下觀察，CGH軟件圖像分析，判別出差異區(qū)帶。再結(jié)合臨床病理資料，進(jìn)一步分析ESCC擴(kuò)增及缺失與臨床病理資料之間的聯(lián)系。 二、ESCC染色體20q及3q

3、高頻擴(kuò)增區(qū)癌基因的篩選與驗(yàn)證 收集了食管鱗狀細(xì)胞癌患者手術(shù)切除標(biāo)本221例，制作出包含364(156例)及325(65例)個(gè)樣本的TMA蠟塊2塊；根據(jù)前面的CGH結(jié)果，選取染色體高頻擴(kuò)增區(qū)20q及3q所包含的幾個(gè)BAC，對(duì)BACDNA標(biāo)記以紅色熒光，用綠色熒光標(biāo)記不含基因的20p12區(qū)BAC或3號(hào)染色體著絲粒作對(duì)照，制備成探針；在含大宗ESCC病例的組織芯片上進(jìn)行間期核雙色FISH雜交，熒光顯微鏡下觀察，圖象分析，判別出探針在腫

4、瘤組織中的擴(kuò)增；并與臨床病理資料以及Ki-67、P53、AR、ER、PR免疫組化結(jié)果分析它們之間的聯(lián)系， 三、ESCC染色體3q與20q區(qū)候選癌基因EIF5A2和SRC-3的免疫組化檢測(cè) 基于FISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)20q12區(qū)的癌基因SRC-3與3q26區(qū)癌基因eIF-5A2的擴(kuò)增參與了部分ESCC的發(fā)病過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)在ESCC組織芯片上應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)SRC-3、eIF-5A2編碼的蛋白在ESCC中的表達(dá)情況以及它們

5、與基因擴(kuò)增之間的關(guān)系；并與臨床病理資料以及Ki-67、P53、AR、ER、PR結(jié)合分析它們之間的聯(lián)系，結(jié)果如下： 1.SRC-3表達(dá)：有94(46％)例腫瘤組織出現(xiàn)SRC-3蛋白的過(guò)度表達(dá)；而癌旁正常食管粘膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞SRC-3蛋白均呈正常表達(dá)。SRC-3蛋白在T3～4期的ESCC中過(guò)度表達(dá)率(66/123，54％)，遠(yuǎn)較T1～2期(28/80，35％，P=0.008，Chi-squaretest)高；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在9

6、4例SRC-3蛋白過(guò)度表達(dá)的病例中，Ki-67的平均陽(yáng)性率為29.7％，明顯高于102例SRC-3蛋白正常表達(dá)組(21.9％)；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。 SRC-3蛋白表達(dá)與它的基因擴(kuò)增存在明顯的相關(guān)性，P=0.0025。在絕大部分(13/15，87％)有SRC-3基因擴(kuò)增的ESCC中，SRC-3蛋白呈過(guò)度表達(dá)，而在59％(59/100)SRC-3基因無(wú)擴(kuò)增的ESCC中，SRC-3蛋白為正常水平表達(dá)。然而，SRC-3

7、基因擴(kuò)增與蛋白的表達(dá)不總是一致。 2.EIF5A2表達(dá)：有44(20.9％)例腫瘤組織出現(xiàn)蛋白的過(guò)度表達(dá)；而癌旁正常食管粘膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞EIF5A2蛋白均呈正常低表達(dá)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ESCC原發(fā)灶中EIF5A2蛋白過(guò)度表達(dá)率為(19/64，29.7％)，明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(25/146，17.1％，P=0.035，Chi-squaretest)；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在43例伴隨EIF5A2蛋白過(guò)度表達(dá)的ESCC中，Ki-6

8、7的平均陽(yáng)性率為29.0％，明顯高于158例EIF5A2蛋白正常表達(dá)組(20.9％)；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)。 EIF5A2蛋白表達(dá)與基因擴(kuò)增之間存在明顯的相關(guān)性，P=0.000。在絕大部分(17/20，85％)有eIF-5A2基因擴(kuò)增的ESCC中，都伴隨有EIF5A2蛋白的過(guò)度表達(dá)。而在eIF-5A2基因無(wú)擴(kuò)增的88％(99/112)ESCC中，EIF5A2蛋白表達(dá)均呈正常水平。然而，eIF-5A2基因擴(kuò)增與蛋白的

9、表達(dá)不總是一致。 四、ESCC染色體3p缺失區(qū)的候選抑癌基因FHIT、HYAL1、RASSF1A的免疫組化檢測(cè) 根據(jù)CGH結(jié)果，選擇了ESCC高頻缺失區(qū)域3p21-3p11上的3個(gè)候選抑癌基因FHIT、HYAL1、RASFF1A，在含大宗病例的ESCC組織芯片上，用免疫組化技術(shù)檢測(cè)這三個(gè)基因編碼蛋白的表達(dá)情況，并與臨床病理資料結(jié)合分析，研究ESCC發(fā)病與這些抑癌基因的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 癌旁正常食管粘膜FHIT蛋白

10、表達(dá)率(37/48，78.1％)遠(yuǎn)較在癌中(24/50，48.0％)高，差異有顯著性(P=0.003)；說(shuō)明FHIT蛋白在癌中表達(dá)明顯下調(diào)。在210例ESCC中，97例(97/210，46.2％)腫瘤組織缺乏FHIT蛋白表達(dá)或表達(dá)下調(diào)；且腫瘤晚期(T3～4期)FHIT蛋白表達(dá)下調(diào)(64/124，51.6％)比T1～2期(33/86，38.4％)更頻發(fā)；差異接近顯著性(P=0.058)。 ESCC中的HYAL1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(22

11、/49，44.9％)似乎較癌旁(13/47，27.7％)高，但差異沒(méi)有顯著性(P=0.079)。在211例ESCC中，有97例(97/211，46.0％)腫瘤組織出現(xiàn)HYAL1蛋白陽(yáng)性表達(dá)。但與臨床病理資料無(wú)明顯的相關(guān)性。 癌旁正常食管粘膜的RASSF1A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(39/50，78.0％)遠(yuǎn)較癌中(23/49，46.9％)高；差異有顯著性(P=0.0014)；說(shuō)明RASSF1A蛋白在癌中表達(dá)明顯下調(diào)。206例ESCC中，1

12、17例(117/206，56.8％)腫瘤組織缺乏RASSF1A蛋白表達(dá)或表達(dá)下調(diào)。腫瘤晚期(T3～4期)RASSF1A蛋白表達(dá)下調(diào)(83/131，63.4％)比T1～2期(45.3％，34/75)更頻發(fā)；差異有顯著性(P=0.012)。分化差的ESCC中RASSF1A蛋白表達(dá)下調(diào)比分化好更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。 根據(jù)上述結(jié)果，我們得出如下結(jié)論： 1.染色體3q、8q、20q、5q、1q、12p的擴(kuò)增以

13、及3p、1p、4p、5q、8p、9p的缺失是華南地區(qū)ESCC發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中的頻發(fā)事件，提示染色體的這些區(qū)域可能存在與ESCC發(fā)生與發(fā)展相關(guān)的癌基因擴(kuò)增與抑癌基因的缺失； 2.ESCC染色體20q區(qū)域存在癌基因SRC-3、ZNF217、STK15、EEF1A2的擴(kuò)增，可能參與ESCC的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程； 3.20q區(qū)域的4個(gè)擴(kuò)增的癌基因SRC-3與ZNF217、STK15、EEF1A2，處于2個(gè)獨(dú)立的擴(kuò)增子上；ZNF217