淚腺腫瘤RASSF1A基因表達異常及臨床意義的研究.pdf

1、淚腺腫瘤是眼眶較為常見的腫瘤之一，嚴重影響患者的外觀，其良性腫瘤容易復(fù)發(fā)和惡變，惡性腫瘤生存率低。淚腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多種基因功能的改變密切相關(guān)，是一個復(fù)雜的多步驟的過程，包括原癌基因的激活(如cerbB-2)和抑癌基因的突變或丟失(如P53)等。Ras相關(guān)區(qū)域家族lA (RASSFlA)是美國學(xué)者Dammann R于2000年從3號染色體短臂(3p21.3)上克隆出來的新型候選抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)該基因與肺癌、食管癌及前列腺癌等多種腺癌

2、的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，目前國內(nèi)外尚無關(guān)于該基因和淚腺腫瘤的關(guān)系的研究。本實驗采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)方法和Western blot方法從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平檢測和分析了正常淚腺組織和淚腺腫瘤組織中ILASSFlA基因表達的差異，觀察RASSFlA基因在淚腺組織中的轉(zhuǎn)錄和表達水平的變化情況，以期發(fā)現(xiàn)淚腺腫瘤早期診斷的方法，檢測淚

3、腺良性腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的高危人群，指導(dǎo)淚腺惡性腫瘤病人術(shù)后的輔助治療，提高患者生存率。 材料和方法 1 標本與分組本研究隨機選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科自2004年9～2007年4月住院手術(shù)病人41名。其中男性21例，女性20例，年齡33～73歲，平均年齡49歲。因為化療、放療對RASSFlA的表達是否有影響還不清楚，所以均選取單一手術(shù)病人。同時根據(jù)患者的病理組織學(xué)檢查結(jié)果，將所取標本進行分組。淚腺良性腫瘤患者的標本21例，

4、分為淚腺良性腫瘤組織組；淚腺惡性腫瘤患者的標本10例，分為淚腺惡性腫瘤組織組；眼眶深部腫瘤組織患者其淚腺組織病理組織學(xué)檢查表現(xiàn)正常者及開放性眼眶損傷患者所切除的損傷部位淚腺共10例，分為淚腺正常組織組。 2 實驗方法取各組標本0.2克離體半小時內(nèi)，立即置入液氮罐速凍，然后保存于-80℃冰箱中備用。用RT-PCR檢測淚腺腫瘤組織及正常淚腺組織中RASSFlAmRNA的表達，比較其差異性，即取0.1克標本提取其組織中的總RNA，并通過電泳和

5、紫外線分光光度儀鑒定總RNA的完整性及純度。對mRNA定量后進行RT-PCR擴增，以β-actin(β-肌動蛋白)作為內(nèi)參照。RT-PCR擴增產(chǎn)物進行電泳分離，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳cDNA條帶，并使用凝膠成像分析軟件對結(jié)果進行相對定量分析。同時采用Western blot方法檢測RASSFlA基因的蛋白半定量表達情況，提取組織中的總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜封閉，一抗鼠抗人RASSFlA抗體孵育，二抗羊抗鼠IGg抗

6、體孵育，DAB顯色試劑盒顯色。 3 觀察項目與指標RT-PCR結(jié)果以mRNA指數(shù)(RI)作為表達水平參數(shù)，即RASSFlA RI=RAS--SFlA mRNA/β-actin mRNA，以x±s記錄實驗結(jié)果。Western blot結(jié)果根據(jù)顯色條帶的強弱，記錄陰性表達和陽性表達的例數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果。 4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS11.0軟件系統(tǒng)進行分析，計量資料采用獨立樣本 t 檢驗，計數(shù)資料采用Fisher’精確檢驗。判定標

7、準為P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差別。 結(jié)果 1 RT-PCR結(jié)果1．1 各組RASSFlA校正值正常淚腺組織、良性腫瘤組織以及惡性腫瘤組織中RASSFlA校正值(RASSFlA/β-actin)分別為0.4240±0.1890、0.2943±0.1605、0.0810±0.0595。 1．2 正常淚腺組織組與良性淚腺腫瘤組織組比較良性腫瘤組織與正常淚腺組織相比，RASSFlA mRNA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，良性腫瘤組

8、織中RASSFlA基因轉(zhuǎn)錄水平明顯低于正常組織(t=3.703，P<0．05)。 1．3 正常淚腺組織組與惡性淚腺腫瘤組織組比較惡性腫瘤組織與正常淚腺組織相比，RASSFlA mRNA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，惡性腫瘤組織中RASSFlA基因轉(zhuǎn)錄水平低于正常組織(t=18.222，P<0.05)。 1.4良性淚腺組織組與惡性淚腺腫瘤組織組比較良性腫瘤組織與惡性腫瘤組織相比，RASSFlA mRNA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，惡性腫

9、瘤組織中RASSFlA基因轉(zhuǎn)錄水平低于良性腫瘤組織(t=11.33 1，P<0.05)。 1.5結(jié)合臨床資料和隨訪結(jié)果分析RASSFlA mRNA的表達值與淚腺腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系良性腫瘤組中1例mRNA的表達值為RI=0.1030(接近惡性腫瘤的表達量)，術(shù)后復(fù)發(fā)。惡性腫瘤組中，l例RASSFlA的tuRNA的表達值為．RI=0.3095(處于淚腺良性腫瘤組織的表達量區(qū)間)，無術(shù)后復(fù)發(fā)史，其余9例RASSFlA的mRNA表達值位于0

10、.0810±0.0595區(qū)間，1例術(shù)后無復(fù)發(fā)，2例復(fù)發(fā)，6例隨訪丟失。 2 Western blot 結(jié)果2.1 各組蛋白表達結(jié)果正常淚腺組織、良性淚腺腫瘤組織及惡性淚腺腫瘤組織均可檢測RASSFlA蛋白，正常淚腺組織全部RASSFlA蛋白表達呈現(xiàn)強陽性(+++)，良性淚腺腫瘤組織11例呈強陽性表達，4例呈中度陽性表達，6例呈弱陽性表達；惡性淚腺腫瘤組織1例呈強陽性表達，2例呈中度陽性表達，7例呈弱陽性表達。惡性淚腺腫瘤組織中R

11、ASSFlA蛋白的表達程度明顯低于良性淚腺腫瘤組織，組間比較具有顯著性差異(P<0.01)。 2．2結(jié)合臨床資料和隨訪結(jié)果分析RASSFlA蛋白表達與淚腺腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系良性腫瘤組中1例RASSFlA蛋白表達弱陽性，術(shù)后復(fù)發(fā)。惡性腫瘤組中，1例蛋白表達強陽性，無術(shù)后復(fù)發(fā)史，其余9例RASSFlA蛋白表達陰性者中，1例術(shù)后無復(fù)發(fā)，2例復(fù)發(fā)，6例隨訪丟失。 結(jié)論 1 RASSFlA mRNA水平在正常淚腺組織中較高，良

12、性淚腺腫瘤組織中稍低，惡性淚腺腫瘤組織中更低，三者之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。正常淚腺組織、良性淚腺腫瘤組織及惡性淚腺腫瘤組織均可檢測出RASSFlA蛋白，但蛋白表達強弱不同，三者之間兩兩比較，差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義。 2 良、惡性淚腺腫瘤組織中RASSFlA基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平上均低于淚腺正常組織(P<0.05)，RASSFlA基因參與了淚腺腫瘤的生長分化，可以阻止正常淚腺組織中細胞異常增生，而缺乏RASSFlA可

13、能引起腫瘤生長。 3 在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平，淚腺惡性腫瘤組織中的RASSFlA基因表達均低于淚腺良性腫瘤組織(P<0.05)，RASSFlA基因的低表達可能是正常淚腺組織及淚腺良性腫瘤組織惡變的機制，其轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)和蛋白表達降低與淚腺組織惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。 4 RASSFlA表達弱的腫瘤，復(fù)發(fā)機率較高，提示RASSFlA在淚腺腫瘤中的低表達可能抑制由多種刺激包括放療化療引起的細胞凋亡而使腫瘤細胞的壽命延長，而這些逃脫凋亡的細胞可