甘藍型油菜莖稈木質素與抗性性狀的相關性研究及全基因組關聯(lián)分析.pdf

1、甘藍型油菜(Brassica napus L,2n=4x=38,AACC)是由白菜型油菜（B.rapa,2n=2x=20，AA）與甘藍（B.oleracea,2n=2x=18，CC）自然雜交后雙倍化得到的異源四倍體物種。它富含油脂和蛋白質，是全世界范圍內廣泛種植的重要油料作物之一。甘藍型油菜不僅是重要的食用油，調味品和蛋白質飼料來源，也是加工工業(yè)及生物能源的重要原料，而且可以為人類提供必要的維生素C和可溶性纖維。
　　核盤菌引起的

2、油菜莖稈腐爛是油菜生產中的首要病害，可以造成油菜產量降低和品質下降；另外，油菜的倒伏問題已成為制約油菜機械化收獲、影響產量和品質、增加菌核病危害的重要因素之一。木質素不僅可以增強植物體的機械強度，同時由于其疏水的化學特性，使植物免受病原菌的侵害和擴展，與植物抗病、抗倒伏有重要的關系。因此，研究甘藍型油菜莖稈木質素在抗病和抗倒伏過程中的作用，鑒定抗性候選基因，可為油菜抗性育種提供理論基礎。本研究首先根據甘藍型油菜莖稈中的酸性洗滌木質素（A

3、DL）和木質素單體（G、S）含量值，建立近紅外模型，實現樣品中ADL和木質素單體含量的快速測定；利用60K Brassica Illumina SNP芯片對莖稈菌核病抗性和抗倒伏性狀（莖稈直徑、折斷力和折斷強度）及木質素和木質素單體含量進行全基因組關聯(lián)分析，鑒定與抗性性狀相關聯(lián)的SNP位點及候選基因，并從轉錄組水平解析木質素合成及甘藍型油菜抗病機理，具體研究結果如下：
　　1. ADL和木質素單體含量近紅外模型建立
　　近紅

4、外光譜是一種快速、無損準確的測定植物化學成分的新方法，本研究采用范式測定法測定了103份材料的莖稈ADL含量，采用GC-MS法測定了152份材料的木質素單體含量，然后采集這些材料的近紅外數據，根據馬氏距離選擇83份材料來建立ADL定標模型，選擇67份材料建立S型木質素單體和G型木質素單體模型，其余材料用于外部驗證。結果表明：
　?。?）ADL最適模型為MPLS回歸分析，無散射和二階導數處理；S型和G型木質素單體最適模型為PLS回歸

5、分析，標準正常化和散射處理（SNV+Detrend）及二階導數處理。
　?。?）ADL模型決定系數（1-VR）約為0.90，外部驗證相關系數（RSQ）分別為0.87；G和S型木質素單體交互驗證決定系數（1-VR）為0.97，外部驗證預測相關系數（RSQ）為0.86；表明本試驗中，ADL、S型和G型木質素單體近紅外模型具有較好的預測效果，可以用于精確定量。
　　2.抗性相關性狀全基因組關聯(lián)分析
　　為了從全基因組水平上解

6、析甘藍型油菜抗病和抗倒伏機理，挖掘與抗性性狀相關聯(lián)的SNP位點，本研究以520份不同來源甘藍型油菜為材料，進行菌核病莖稈抗性鑒定，并測定莖稈中部直徑，折斷力，抗折強度（單位面積折斷力）及倒伏系數；根據上述建立的ADL、S型和G型木質素單體近紅外模型，測定各材料的ADL含量、S型和G型木質素單體含量，由于H型木質素單體含量很少，本研究后續(xù)分析從S型和G型木質素單體比例（S/G）入手，探討木質素單體比例與抗性的關系。這7個性狀都進行兩年兩次

7、重復鑒定，同時利用60K Brassica Illumina SNP芯片分析的基因型，進行甘藍型油菜抗性相關性狀的全基因組關聯(lián)分析。結果表明：
　?。?）甘藍型油菜相對感病性與莖稈總木質素含量無關，但與木質素單體比S/G達到顯著正相關；莖稈直徑與折斷力達到顯著正相關；莖稈折斷力和抗折強度與ADL木質素總含量正相關；莖稈ADL木質素總量與木質素單體比S/G達到極顯著正相關，倒伏系數與抗折強度和木質素單體比S/G達到顯著正相關。表明組

8、成油菜莖稈木質素時，S型木質素單體含量較高，但G型木質素單體在抗病和抗倒伏過程中起著重要作用，抗折強度可以作為評價倒伏的重要指標。
　?。?）從60K SNP芯片中篩選出31468個有多態(tài)性和高質量的SNP分析連鎖不平衡衰減距離。當LD的衰減閾值為0.1時，A基因組的衰退距離約為1 Mb，C基因組的衰退距離約為10 Mb，表明A基因組較C基因組衰減速度快，可能是中國半冬性甘藍型油菜在育種中A基因組發(fā)生較大重組，打破了連鎖不平衡。<

9、br>　　（3）根據SNP在染色體上位置，檢測各染色體單體型分布情況。A和C基因組平均單體型塊大小分別為133.3 kb和177.5 kb（F=8.5，P=0.019）；A基因組每100 kb內單體型塊數目平均為0.18，C基因組為0.04（F=102.5，P<0.01）。A基因組單體型塊數目多，長度短，C基因組單體型塊數目少，長度長，表明A基因組較C基因組發(fā)生較大重組，打破之前的連鎖狀態(tài)，被分割為多個長度小的單體型塊。
　?。?

10、）通過群體遺傳結構，Neighbor-join進化樹及主成分分析劃分自然群體類群。520份材料劃分為3個類群，亞群1（Group1）包含53份材料，亞群2（Group2）包含348份材料，剩余的119份材料聚入混合亞群（Mixed），其分類與甘藍型油菜生態(tài)型一致。亞群1主要是由分布在中國甘肅和青海地區(qū)及歐洲的春油菜構成，亞群2主要是由分布在長江流域地區(qū)的半冬性油菜構成，包括重慶、四川、湖南、湖北及江蘇地區(qū)選育的品種。
　?。?）對

11、7個抗性相關性狀表型和60K Brassica Illumina SNP芯片分析的基因型進行全基因組關聯(lián)分析，共檢測到109個顯著關聯(lián)的SNP位點。莖稈菌核病抗性利用K+P模型，鑒定出17個與抗性顯著關聯(lián)的SNP位點，分別位于A8染色體上的15.1 Mb和C6的31.3 Mb位置，A8上與菌核病抗性顯著關聯(lián)的SNP位點位于長度為409 kb的單型體內，C6染色體上的SNP位點，與已經報道的菌核病QTL位點有重疊；莖稈中部直徑利用K+Q模

12、型，共檢測到3個SNP標記與直徑顯著關聯(lián)，分別位于A2（6 Mb）和A7（18.5 Mb）染色體上；莖稈折斷力利用K+P和K+Q模型共檢測到關聯(lián)的11個SNP，位于A2染色體上約24.1 Mb，A7染色體上約20.9 Mb，A9染色體上約2.5 Mb和2.9 Mb，及C3染色體上約48.4 Mb；對抗折強度，檢測到7個與抗折強度相關聯(lián)的SNP位點位于A1染色體18 Mb。A5染色體20.3 Mb，A7染色體20.9 Mb；對倒伏系數，檢

13、測到5個與倒伏系數關聯(lián)SNP位點；對ADL，找到8個與木質素含量關聯(lián)的SNP位點；對木質素單體比S/G，幾乎在所有染色體都找到與其關聯(lián)的SNP位點，共找到58個顯著關聯(lián)SNP位點（P<1.37×10-5），當利用較為嚴格的閾值時（P<1.58×10-6），共找到6個關聯(lián)SNP位點，位于A3染色體6.9 Mb和14.7-18.4 Mb，A6染色體17.9 Mb，A7染色體11.1 Mb。另外ADL木質素與木質素單體比S/G都在A1染色體約

14、1.0Mb處找到顯著關聯(lián)的SNP位點，并在附近找到與CAD5同源基因（BnaA01g02890D）。倒伏系數LC與木質素單體比S/G，相對感病性與木質素單體比S/G都找到共同的顯著關聯(lián)SNP位點，表明木質素單體在抗性過程中起著重要作用。
　?。?）對7個抗性性狀進行全基因組選擇，7個性狀隨著參考材料數目的增加預測能力升高，但是標準差也隨著升高，結合預測能力和標準差，選用60％的參考材料時最為合適。利用所有標記進行全基因組選擇時，這

15、些性狀的預測效率為0.23（直徑）-0.42（折斷力），預測效率很低；利用全基因組關聯(lián)分析顯著SNP位點（P<0.05）進行全基因組預測時，相對感病性，預測能力為0.8，莖稈中部直徑、折斷力、抗折強度、ADL、木質素單體比S/G預測能力都約為0.6-0.7，說明這些標記具有預測能力，全基因關聯(lián)分析檢測的顯著關聯(lián)位點可以提高性狀預測能力，促進全基因組選擇進程。
　　3.甘藍型油菜木質素合成基因表達差異分析
　　為了了解甘藍型油

16、菜莖稈木質素合成過程中基因表達情況，本研究從520份材料中各選取5份高木質素含量和低木質素含量材料，在初花期取莖稈中部組織，利用高通量RNA-Seq測序技術構建了油菜低木質素（L1）和高木質素（H2）轉錄組文庫，找到與木質素合成相關的途徑及基因。主要研究結果如下：與低木質素含量材料FPKM相比后，尋找表達值相差至少2倍的差異基因（log2(H2/L1)≥1，FDR<0.01），與木質素合成相關的差異表達基因共1013個，其中上調基因35

17、1個，下調基因662個。DGEs的GO富集分析進行統(tǒng)計檢驗，結果表明，與低木質素材料中的基因相比，高木質素材料上調基因位于細胞器，主要分子功能是轉運活性（transporter activity），主要參與在糖苷分解代謝過程（尤其是硫苷分解），葉片衰老和細胞壁生物合成過程中；下調基因主要參與次級代謝過程和硫苷生物合成過程中，表明硫苷代謝途徑與木質素合成途徑相關。另外，對這些基因進行KEGG富集分析，上調表達基因中，沒有代謝途徑達到顯著富

18、集水平；而下調表達基因有11個代謝途徑達到顯著富集水平。顯著富集的前5個代謝途徑為硫苷生物合成（ath00966）、氧帶羧酸代謝（ath01210）、硫代謝（ath00920）、硫胺素代謝（ath00730）和類黃酮代謝（ath00941），這個結果與GO富集分析結果一致。另外，我們還鑒定了一些在其他作物木質素代謝途徑中起著重要作用的轉錄因子基因（如MYB85和MYB103），也可以調控甘藍型油菜木質素的生物合成。結合全基因組關聯(lián)分析，

19、找到4CL5同源基因（BnaA03g36130D）。另外，我們還找到一個ERF轉錄因子基因SHINE（BnaA08g233880D），其可能參與木質素生物合成。
　　4.甘藍型油菜應答核盤菌侵染的轉錄組分析
　　為了從轉錄水平解析甘藍型油菜抗病機制，我們從520份材料中分別選擇5份極端抗?。≧）和感?。⊿）甘藍型油菜，核盤菌脅迫接種莖稈48 h，分別取抗病材料和感病材料接種前后各10株混合樣提RNA，利用RNA-seq技術進

20、行轉錄組測序，得到抗、感材料核盤菌脅迫處理后上調和下調的基因，結果如下：
　　（1）根據log2(FPKM48/FPKM0)≥2，FDR<0.01，R和S材料中接種前后共發(fā)現6821個差異基因，R中有5384個差異表達基因，包括2356個上調基因（43.8%）和3028個下調基因（56.2%）；感病性材料（S）中共5386個，包括2229個上調基因（41.4%），3157個下調基因（58.6%）。其中共有的上調基因1784個，57

21、2個基因在R材料中特異上調，445個基因在S材料中特異上調；R和S材料共同下調的基因則有2166個，R材料特異下調基因862個，S材料特異下調基因991個。另外，對所有差異基因進行分層聚類發(fā)現，R和S材料中差異基因表達模式一致，基因表達水平的差異主要表現為上調或下調倍數的差異；
　　（2）對共同表達差異基因進行了GO功能富集，從細胞組分，分子功能和參與的生物過程三個方面來分析。共同表達的上調基因主要在細胞部分（cell），其分子功

22、能是催化和結合功能，編碼轉運蛋白，參與的生物過程為代謝過程，細胞過程，生物調節(jié)和對刺激的反應。而下調的基因除了在細胞上，細胞器上的比例也很高，主要是與光合作用相關的葉綠體及類囊體；
　?。?）對抗病和感病中共同表達的差異基因KEGG代謝途徑分析，結果表明，上調基因主要富集在谷胱甘肽代謝和次級代謝生物合成（硫代謝，硫苷生物合成和氧帶羧酸代謝中），下調基因主要富集在光合作用，乙醛酸和二羧酸代謝途徑，固碳作用，葉綠素代謝過程和碳代謝過程

23、中；
　?。?）對抗病和感病材料差異表達基因進行分析，找到一些特異的與抗性相關的途徑及基因，包括茉莉酸途徑，木質素途徑，信號傳導途徑，防御反應及轉錄因子基因。木質素途徑中，R材料CCoAOMT基因全部上調，上調的倍數大于感病材料；F5H基因在R和S材料中都表現為下調。CCoAOMT主要參與G型木質素單體的合成，而F5H參與S型木質素單體合成，表明G型木質素單體在抗病過程中起著重要作用。
　　（5）結合全基因組關聯(lián)分析，我們還