活細胞內GLUT4囊泡納米級三維實時定位技術的研究.pdf

1、葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）在肌肉細胞和脂肪細胞的葡萄糖攝取過程中起著重要作用。有研究表明，GLUT4響應胰島素刺激向細胞膜募集，促進細胞對葡萄糖的攝取。這一過程的失調與Ⅱ型糖尿病相關。研究活細胞內GLUT4囊泡的轉運過程，可以進一步加深對Ⅱ型糖尿病發(fā)病機理的研究，并尋找更有效的治療手段。由于三維單微粒定位技術的局限性以及所使用的熒光標記物易于漂白且熒光強度相對較弱的缺陷，目前對GLUT4胞內轉運機制的研究僅局限于觀察GLUT4囊泡在

2、細胞內轉運的某些短時程或者局部區(qū)域的片段。在三維空間內對GLUT4進行長時程的實時定位，能夠為研究活細胞內GLUT4的轉運過程提供新的證據(jù)。本文的目的就是研究和開發(fā)一種活細胞內GLUT4囊泡納米級三維實時定位技術，為我們研究活細胞內GLUT4轉運提供新的手段。
　　本文利用量子點（QDs）標記活細胞內的GLUT4。由于QDs具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光亮度高以及耐光漂白等優(yōu)點，所以標記了QDs的GLUT4克服了傳統(tǒng)熒光標記物熒

3、光圖像信噪比低及不能夠進行長時程成像觀察的缺點。同時，利用熒光點離焦圖像與離焦距離的關系，可以設計單微粒納米級三維實時定位算法，構建單微粒納米級三維實時定位系統(tǒng)。本文主要內容如下：
　?。?）研究QDs標記活細胞內GLUT4的實驗方法。通過一系列實驗，我們利用調節(jié)反應溫度和試劑濃度的方法，標記了活細胞表面的GLUT4，并觀察GLUT4在活細胞撤去胰島素刺激的狀態(tài)下胞吞進入特定細胞器的過程。通過實驗證明利用QDs標記活細胞內GLUT

4、4的實驗方法具有特異性強、靈敏度高、光毒性小且容易被檢測的優(yōu)點。
　?。?）設計單微粒納米級三維實時定位算法。通過實驗和計算，推導出實驗室所用熒光顯微成像系統(tǒng)中熒光點離焦圖像最外層圓環(huán)半徑與離焦距離的關系，并進一步推導出利用離焦圖像最外層圓環(huán)半徑計算離焦距離的公式。繼而為實現(xiàn)單微粒納米級三維實時定位設計圖像處理算法，包括熒光圖像的預處理算法、通過迭代的質心算法計算熒光點X-Y平面上的位置以及測量離焦圖像最外層圓環(huán)半徑以計算熒光點離