地塞米松拮抗聲損傷及慶大霉素耳毒性的實驗研究.pdf

1、噪聲性聾及藥物性聾是常見的感音神經(jīng)性聾,嚴重影響人們的生活質量。長期以來,對聲損傷和慶大霉素耳毒性的防治一直是廣大耳科工作者致力研究的課題。地塞米松作為合成的糖皮質激素,具有多種生理功能。已有研究發(fā)現(xiàn),地塞米松能減小噪聲及氨基甙類藥物的耳毒性,但對這一現(xiàn)象機制的研究少有報道。
　　 地塞米松作為糖皮質激素,通過基因組途徑及非基因組途徑發(fā)揮作用。在基因組途徑中,地塞米松通過與位于胞漿的糖皮質激素受體(Glucocorticoid

2、receptor,GR)結合,進而影響某些基因的轉錄與表達,因此了解GR在耳蝸的的分布很有必要。既往的研究應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、原位雜交、免疫組織化學方法研究糖皮質激素在內耳的分布,而應用直觀的免疫熒光技術分析GR在耳蝸的分布及聲損傷對GR表達的影響還未見報道。
　　 Notch信號系統(tǒng)幾乎涉及所有細胞的增殖、分化活動,Hes1(hairy and enhaiicer of split 1)為Notch的基本效應因

3、子。Hes1mRNA表達水平增高提示Notch信號活化,導致CDK(Cyclin-dependent kinases,周期性蛋白依賴激酶)抑制物p21Wafl/Cip的聚集,而后者與細胞凋亡密切相關。噪聲、地塞米松與hes 1 mRNA表達的關系可能是地塞米松拮抗聲損傷的機制之一,對這一現(xiàn)象未見相關報道。
　　 地塞米松拮抗氨基甙類抗生素耳毒性的在體研究已有報道,離體實驗避免了全身因素的干擾和影響,使研究途徑更加便捷可靠。觀察地

4、塞米松是否拮抗慶大霉素對體外培養(yǎng)的Corti器的耳毒性,尚未見報道。
　　 抑制外毛細胞Ca2+敏感的外向K+電流可能是氨基甙類抗生素耳毒性的機制之一,地塞米松是否通過非基因組途徑影響該電流,從而拮抗慶大霉素耳毒性,尚未見報道。
　　 因此,本研究的主要目的是探討地塞米松對聲損傷及慶大霉素耳毒性的影響及相關機制。以免疫熒光技術定位,熒光強度半定量分析為指標,探討了糖皮質激素受體在豚鼠耳蝸的分布,聲損傷后對其分布及各區(qū)域表

5、達強度的影響。以聽覺腦干誘發(fā)電位(ABR),耳蝸形態(tài)學為指標探討地塞米松減輕耳蝸聲損傷的作用;用RT-PCR及熒光實時定量PCR技術,探討噪聲及地塞米松對豚鼠耳蝸hes 1 mRNA表達水平的影響。以免疫熒光技術定位,耳蝸形態(tài)學毛細胞計數(shù)為指標,探討地塞米松減輕慶大霉素對離體培養(yǎng)的耳蝸Cord器的毒性作用。以聽覺腦干誘發(fā)電位(ABR)為指標探討地塞米松減輕慶大霉素耳毒性的作用;應用全細胞膜片鉗記錄技術探討慶大霉素耳毒性及地塞米松拮抗慶大

6、霉素耳毒性的離子通道機制。
　　 第一部分地塞米松拮抗內耳聲損傷的實驗研究
　　 一、糖皮質激素受體在豚鼠耳蝸的分布及聲損傷對其表達的影響
　　 目的:研究GR在豚鼠耳蝸的分布及聲損傷對豚鼠耳蝸GR表達的影響。
　　 方法:豚鼠隨機分為二組:實驗組予噪聲暴露,噪聲為白噪聲,強度115dBSPL,暴露時間3h。暴露結束后2h斷頭剝取耳蝸。正常對照組不做處理,與實驗組同時剝取耳蝸。制備耳蝸冰凍切片,免疫熒光技

7、術觀察豚鼠耳蝸GR表達情況,并進行熒光強度半定量分析。
　　 結果:(1)豚鼠耳蝸GR主要的陽性部位在螺旋韌帶、血管紋、骨螺旋唇、Corti器以及螺旋神經(jīng)節(jié)。螺旋韌帶、血管紋、骨螺旋唇以及螺旋神經(jīng)節(jié)等區(qū)域GR熒光強度無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05),而上述各區(qū)域與Corti器的GR熒光強度相比,差異有顯著意義(P＜0.05)。(2)聲損傷后豚鼠耳蝸GR熒光強度在骨螺旋唇、corti器以及螺旋神經(jīng)節(jié)較正常對照組無統(tǒng)計學意義(P＞0

8、.05),而螺旋韌帶、血管紋區(qū)域熒光強度較正常對照組明顯減低,有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 結論:GR在豚鼠耳蝸分布于螺旋韌帶、血管紋、corti器和螺旋神經(jīng)節(jié),其中螺旋韌帶、血管紋區(qū)域表達最強,corti器區(qū)域表達最弱;聲損傷降低耳蝸各區(qū)域GR的表達,以血管紋、螺旋韌帶最顯著。
　　 二、地塞米松拮抗耳蝸聲損傷及對豚鼠耳蝸hes1表達水平的影響
　　 目的:探討地塞米松拮抗聲損傷及與耳蝸hes1mR

9、NA的表達的關系。
　　 方法:在預實驗的基礎上,豚鼠隨機分為5組,空白對照組,NSipqd+植物油imqd;噪聲組(N),NSipqd+植物油imqd+噪聲暴露;地塞米松+噪聲組(Dex+N),Dexipqd+植物油imqd+噪聲暴露;RU486+噪聲組(RU+N),NSipqd+RU486imqd+噪聲暴露;地塞米松+RU486+噪聲組(Dex+RU+N),Dexipqd+RU486imqd+噪聲暴露。其中地塞米松劑量1mg

10、/kg,濃度0.5mg/ml;RU486劑量20mg/kg,濃度25mg/ml。藥物作用時間均為5d。噪聲暴露于白噪聲3小時,強度115dBSPL。噪聲暴露結束即刻處死。取下顳骨,冰盒中取出耳蝸,用熒光實時定量PCR(real-time-PCR)檢測耳蝸組織hes1mRNA的表達。同樣分組條件下,在噪聲暴露前、噪聲暴露結束后24小時測定Crick和短純音(2、4、6、8kHz)ABR反應閾值,空白對照組在實驗開始和結束各測定一次ABR。

11、各組動物進行耳蝸NBT染色及基底膜鋪片。
　　 結果:(1)白噪聲115dBSPL,暴露3h,促進豚鼠hes1 mRNA表達增加約3倍;地塞米松預處理5d,可以使hes1mRNA表達水平接近于對照組。Dex-RU486-noise組hes1 mRNA表達水平接近于noise組,說明RU486基本上阻斷了地塞米松下調豚鼠耳蝸hes1 mRNA表達水平的作用。(2)各組ABR平均閾移:空白對照組閾移為0.5～1.40dB:噪聲組cl

12、ick閾移為29.56dB,短純音(2、4、6、8kHz)閾移為32.75～34.78dB;地塞米松+噪聲組click閾移為11.46dB,短純音(2、4、6、8kHZ)閾移為12.75～15.85dB;RU486+噪聲組click閾移為26.93dB,短純音(2、4、6、8kHz)閾移為30.15～33.26dB;地塞米松+RU486+噪聲組click平均閾移為27.38dB,短純音2、4、6、8kHz閾移為30.26～33.52dB

13、。噪聲組、地塞米松+RU486+噪聲組分別與地塞米松+噪聲組相比,全頻的ABR閾移均有顯著性差異(p＜0.05)。(3)耳蝸基底膜NBT染色顯示噪聲組底回損傷較重,地塞米松+噪聲組損傷輕微。
　　 結論:地塞米松對耳蝸聲損傷具有拮抗作用;下調耳蝸hes1 mRNA的表達水平,減少細胞凋亡,可能是地塞米松對聲損傷發(fā)揮保護作用的機制之一。
　　 第二部分地塞米松拮抗慶大霉素耳毒性的實驗研究
　　 一、地塞米松拮抗慶大

14、霉素耳毒性作用的離體實驗研究
　　 目的:采用Corti器體外培養(yǎng)的方法,觀察地塞米松是否對慶大霉素的耳蝸毒性具有拮抗作用。
　　 方法:成功建立耳蝸Corti器體外培養(yǎng)系統(tǒng)后,選取出生3d的SD大鼠,隨機分為3組,正常對照(Control)組,進行Corti器體外培養(yǎng),72h后中止培養(yǎng);慶大霉素(GM)組,培養(yǎng)48h后加入慶大霉素液(濃度0.5mmol/L),作用24h后中止培養(yǎng);地塞米松+慶大霉素(Dex+GM)組,

15、培養(yǎng)24h后加入地塞米松溶液(濃度100ng/mL),培養(yǎng)48h后加入慶大霉素液(濃度0.5mmol/L),培養(yǎng)72h后中止培養(yǎng)。各組中止培養(yǎng)后,Rhodamine-phalloidin染色,免疫熒光技術觀察Corti器毛細胞生長狀況。
　　 結果:正常對照(Control)組毛細胞無明顯缺失;慶大霉素(GM)組外毛細胞有明顯缺失,而內毛細胞基本無明顯改變,三排外毛細胞中以內兩排損害較重;地塞米松+慶大霉素(Dex+GM)組可見

16、外毛細胞的缺失程度明顯減輕,內毛細胞基本無明顯改變。
　　 結論:地塞米松預處理對離體耳蝸Corti器的慶大霉素耳毒性具有拮抗作用。
　　 二、地塞米松拮抗慶大霉素耳毒性作用的電生理學研究
　　 目的:探討地塞米松拮抗慶大霉素耳毒性的離子通道機制。
　　 方法:(1)豚鼠隨機分為6組,生理鹽水(control)組,生理鹽水0.5ml,ip;慶大霉素(GM)組,慶大霉素80mg/kg,im;地塞米松低濃度(

17、Dex-1)組,地塞米松0.2mg/kgip;地塞米松高濃度(Dex-h)組,地塞米松1mg/kgip;地塞米松低濃度+慶大霉素(Dex-1+GM)組,地塞米松0.2mg/kgip,慶大霉素80mg/kg,im;地塞米松高濃度+慶大霉素(Dex-h+GM)組,地塞米松1mg/kgip,慶大霉素80mg/kg,im。給藥前及給藥結束后,測定ABR反應閾,計算ABR閾移。(2)全細胞膜片鉗技術記錄單離外毛細胞鈣敏感外向鉀電流。分別觀察0.1

18、、1、10、100、1000umol/L慶大霉素對鈣敏感外向鉀電流的影響;全細胞膜片鉗技術記錄單離外毛細胞鈣敏感外向鉀電流。分別觀察0.1、1、10、100、1000umol/L地塞米松對鈣敏感外向鉀電流的影響。
　　 結果:(1)生理鹽水(control)組、Dex-1組和Dex-h的ABR平均閾移很小,為1.0～1.6dB;GM組click平均閾移為10.6dB,短純音在5.0～21.0dB之間,并以6kHz及8kHz的閾移

19、最為明顯;Dex-1+GM組Dex-h+GM組click平均閾移為5.8～7.2dB,短純音在2.5～5.2dB之間,與GM組相比有顯著性差異(p＜0.05)。(2)慶大霉素以濃度依賴性方式抑制外毛細胞Ca2+敏感的外向K+電流;地塞米松以濃度依賴方式增大外毛細胞Ca2+敏感的外向K+電流。
　　 結論:地塞米松能夠顯著降低慶大霉素對豚鼠的耳毒性,并且對豚鼠聽功能沒有明顯影響;慶大霉素抑制外毛細胞Ca2+敏感的外向K+電流,可能