單細胞水平黃芪多糖對肝竇內(nèi)皮細胞微區(qū)力學影響的研究.pdf

1、肝纖維化(Hepatic fibrosis，HF)是各種慢性肝病進展至肝硬化必經(jīng)的病理過程，現(xiàn)已證實肝纖維化在一定程度上可逆。肝竇內(nèi)皮細胞(Sinusoidal endothelialcells，SECs)作為肝臟非實質(zhì)細胞之一，是肝竇壁的組成細胞，直接接受血流等力學刺激作用，其結構與功能可維持正常的肝臟微循環(huán)。當肝竇內(nèi)皮細胞力學性質(zhì)或其力學微環(huán)境發(fā)生改變時，其獨特的窗孔結構就會消失并在內(nèi)皮下形成基底膜，即所謂的肝竇毛細血管化，這成為肝

2、纖維化形成的病理基礎，繼而導致肝纖維化的發(fā)生，故肝竇內(nèi)皮細胞在肝纖維化的形成過程中具有十分重要的作用。大量臨床實踐證實，肝纖維化的基本病機特點為氣虛血瘀，黃芪作為補氣中藥的代表，臨床及實驗研究均證實其具有很好的抗肝纖維化作用，而黃芪多糖是黃芪中含量最多的有效單體成分。本實驗以體外培養(yǎng)的肝竇內(nèi)皮細胞為研究對象，觀察細胞的超微結構，并初步探討黃芪多糖干預后細胞微區(qū)力學性質(zhì)的變化，為進一步研究能否通過改變肝竇內(nèi)皮細胞的結構與力學性質(zhì)來逆轉肝纖

3、維化奠定一定的實驗基礎。
　　本論文內(nèi)容分為兩部分：實驗研究和文獻研究。
　　第一部分：實驗研究
　　一、肝竇內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)、鑒定及納米成像
　　目的：本研究以肝竇內(nèi)皮細胞為研究對象，通過對肝竇內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)及鑒定，借助以原子力顯微鏡(Atomic force microscopy，AFM)為主體的高分辨原位成像技術以及低真空環(huán)境掃描電子顯微鏡(Environmental scanning electro

4、nmicroscope，ESEM)，在單細胞水平進行肝竇內(nèi)皮細胞微尺度形貌結構的納米成像。方法：采用大鼠肝臟原位膠原酶灌注、Percoll密度梯度離心結合選擇性貼壁的方法分離并純化肝竇內(nèi)皮細胞，CD14染色證實細胞的純度。將肝竇內(nèi)皮細胞脫水、干燥并固定后，在低真空環(huán)境掃描電子顯微鏡下觀察細胞的超微結構。運用納米中心實驗室已建立的原子力顯微鏡/快速激光共聚焦熒光顯微鏡(Laserscanning confocal fluorescence

5、 microscope，LSCFM)/全內(nèi)反射熒光顯微鏡(Totalinternal reflection fluorescence microscope，TIRFM)聯(lián)合成像系統(tǒng)，實現(xiàn)肝竇內(nèi)皮細胞活體三維形貌成像。結果：原代培養(yǎng)出的細胞CD14染色陽性鑒定為肝竇內(nèi)皮細胞。在倒置顯微鏡下可觀察并記錄肝竇內(nèi)皮細胞不舊時期的生長鋪展狀態(tài)；將細胞脫水固定后，在低真空環(huán)境掃描電子顯微鏡下可清晰的看到細胞窗孔大小、微絲的分布以及細胞之間的連接情況

6、等超微結構；利用原子力顯微鏡可對液態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中的附壁肝竇內(nèi)皮細胞進行實時動態(tài)三維納米成像。結論：運用改良后的肝臟原位膠原酶灌注、Percoll密度梯度離心結合選擇性貼壁法能夠獲得純度較高、活力較強的肝竇內(nèi)皮細胞；運用環(huán)境掃描電鏡及原子力顯微鏡可以對體外培養(yǎng)的肝竇內(nèi)皮細胞進行納米成像。
　　二、單細胞水平黃芪多糖對肝竇內(nèi)皮細胞微區(qū)力學影響的研究
　　目的：本研究以體外培養(yǎng)的肝竇內(nèi)皮細胞為研究對象，運用原子力顯微鏡力譜技術，探討

7、黃芪多糖對單細胞水平肝竇內(nèi)皮細胞微區(qū)力學作用的影響，初步研究肝竇內(nèi)皮細胞在受到藥物干預后細胞的微區(qū)力學響應，為進一步開展中藥干預肝竇內(nèi)皮細胞損傷模型的肝纖維化研究奠定實驗基礎。方法：利用原子力顯微鏡采集力曲線，應用力譜技術，計算肝竇內(nèi)皮細胞的楊氏模量；同時應用單一濃度的黃芪多糖干預肝竇內(nèi)皮細胞，采集力曲線并計算楊氏模量，比較黃芪多糖干預組和對照組的楊氏模量，初步探討黃芪多糖對肝竇內(nèi)皮細胞微區(qū)力學影響，從而建立體外黃芪多糖/肝竇內(nèi)皮細胞微

8、區(qū)力學實驗體系。結果：運用原子力顯微鏡采集力曲線并統(tǒng)計計算后得出：當探針壓入深度為300納米時，黃芪多糖組細胞的楊氏模量中位數(shù)為0.644107千帕，空白對照組為0.448870千帕；當探針壓入深度為500納米時，黃芪多糖組細胞的楊氏模量中位數(shù)為0.700691千帕，空白對照組為0.540682千帕；無論探針壓入深度為300納米還是500納米，黃芪多糖干預組所測得的肝竇內(nèi)皮細胞楊氏模量中位數(shù)均明顯高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P值

9、<0.01)。結論：原子力顯微鏡可以通過對肝竇內(nèi)皮細胞局部施力并描繪力曲線來研究細胞的彈性等微區(qū)力學性質(zhì)；肝竇內(nèi)皮細胞在50微克/毫升濃度的黃芪多糖作用下，細胞楊氏模量顯著增加，即黃芪多糖在此濃度下能夠使肝竇內(nèi)皮細胞的剛性增加而變“硬”，提示：黃芪多糖可能是通過使細胞變“硬”以減少血流作用于肝竇壁的能量耗散，從而提高了血流剪應力，使血流動力學發(fā)生改變，進而能夠改善肝臟微循環(huán)。
　　第二部分文獻研究：
　　本部分從目前肝竇內(nèi)皮