河蜆貝殼粉對小鼠酒精性脂肪肝形成的抑制作用及相關(guān)免疫學機制初步探討.pdf

1、近年來，隨著人們生活水平的提高以及生活習慣的改變，酗酒人數(shù)不斷增多，酒精已成為繼病毒性肝炎后導致肝損害的第二大病因。長期重度飲酒者中，90％以上有一定程度的脂肪肝。脂肪肝的最早表現(xiàn)是脂肪變性，同時伴隨脂質(zhì)代謝紊亂，如甘油三酯（Triglyceride，TC）的合成增加、脂肪輸出減少以及肝外脂肪動員等。目前，關(guān)于酒精性脂肪肝(Alcoholic fatty liver，AFL)的免疫學機制研究備受關(guān)注，但是具體相關(guān)機制有待闡明。在AFL患

2、者中，酒精通過各種途徑導致巨噬細胞功能異常、氧化應(yīng)激、脂肪組織的蓄積和腸道菌群的過度繁殖，進而刺激炎性細胞并釋放各種炎癥細胞因子，如腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)等，導致肝細胞損傷及肝臟炎性反應(yīng)。目前關(guān)于酒精性脂肪肝(Alcoholic fatty liver，AFL)的治療關(guān)鍵是戒酒。去除酒精影響因素后，脂肪變性可恢復正常。若防治不當，在脂肪出現(xiàn)異常變化過程中發(fā)生的脂質(zhì)代謝紊亂可使肝

3、細胞遭受損害。隨著肝內(nèi)脂肪堆積的增多，肝細胞損害也隨之加重，肝臟罹患相關(guān)性疾病的風險就越高。所以，抑制AFL的形成對于防治肝臟疾病至關(guān)重要。河蜆盛產(chǎn)于日本北部本州青森縣。當?shù)鼐用耖L期食用高溫煅燒后的河蜆殼粉(Fired Shell Powder, FSP)作為一種民間醫(yī)藥治療肝臟疾病。最近，日本學者Sasaki等研究發(fā)現(xiàn)500℃高溫煅燒下提取的FSP能夠明顯改善急性肝炎模型大鼠的肝功能，并且能通過增強NK細胞殺傷活性來促進肝臟的炎癥吸收

4、。關(guān)于FSP是否能夠抑制酒精性脂肪肝的形成及其相關(guān)機制有待闡明。為此，本實驗通過AFL模型小鼠，觀察經(jīng)FSP處理后，小鼠體內(nèi)血脂、肝功能、肝組織內(nèi)TNF-a、IL-6和IL-10的mRNA表達水平及脾細胞培養(yǎng)上清中TNF-a、IL-6和IL-10的含量的變化等情況，為證實FSP能夠抑制AFL的形成及其相關(guān)機制提供理論和實驗依據(jù)。
　　 實驗方法:
　　 1、實驗動物及主要試劑
　　 6～8W清潔級雌性C57BL/

5、6小鼠，購于上海中國科學院實驗動物中心。
　　 煅燒的貝殼粉（由日本弘前大學SASAKI教授惠贈），RPMI-1640培養(yǎng)液，標準胎牛血清，0.01M PBS緩沖液，紅細胞裂解液，四甲基偶氮唑鹽，胰蛋白酶，TNF-a、IL-6和IL-10ELISA試劑盒，RNA LA PCRrM Kit Ver.1.1等。
　　 2、實驗動物分組及處理
　　 將C57BL/6小鼠隨機分成3組：正常對照組(Controlgroup

6、)8只，AFL組和AFL+FSP組各10只。AFL+FSP組每天上午9:00每只小鼠灌胃FSP懸液0.5ml，正常對照組和AFL組同法給予等量雙蒸水；灌胃30min以后，AFL組和AFL+FSP組每只小鼠腹腔注射10％乙醇溶液1ml，正常對照組腹腔注射1ml生理鹽水；連續(xù)處理14天。
　　 3、樣品的采集與指標檢測
　　 (1)血脂四項及肝功能的檢測末次處理的次日，眼球取血，離心收集血清。利用全自動化分析儀測定小鼠血清總

7、膽固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein cholesterol，HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol，LDLC)、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic pyruv

8、ic transaminase，GPT)和總膽紅素(Total bilirubin，TBil)的產(chǎn)生水平。
　　 (2)肝組織形態(tài)學觀察迅速摘取小鼠肝臟，于肝右葉剪取0.5cm×0.5cm大小肝組織，4％多聚甲醛固定48h，制作石蠟切片。HE染色，光學顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學改變。
　　 (3)肝細胞懸液的制備及肝細胞存活率的測定通過胰蛋白酶冷消化法分離提取肝細胞，調(diào)整細胞濃度為1×107／ml。以1×106/ml濃度接

9、種細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)至不同時間點，利用MTS試劑盒測定各細胞培養(yǎng)孔內(nèi)的OD492值，并計算肝細胞存活率。
　　 (4)脾細胞分離及其懸液制備頸椎脫位處死小鼠，常規(guī)無菌制備脾細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至1×107／ml。
　　 (5)實時熒光定量(RealTime)PCR技術(shù)檢測法檢測肝組織內(nèi)TNF-a、IL-6和IL-10mRNA的表達水平。
　　 (6)雙抗體夾心ELISA試劑盒分別檢測各組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中TNF-

10、a、IL-6和IL-10的分泌水平，酶標儀測定450nm處OD值。結(jié)果以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線，應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1 Ls軟件分析，計算細胞因子含量(pg/ml)。
　　 (7)統(tǒng)計學處理采用SPSS16.0軟件分析結(jié)果，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((-x)±s)表示，采用獨立樣本t檢驗進行組間比較。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1、FSP對實驗小鼠血脂的影響
　　 FSP處理C57BL/6小

11、鼠后，小鼠血清中血脂的產(chǎn)生水平結(jié)果為：AFL組血清中TG、TC、HDLC和LDLC的水平均顯著高于正常對照組(P值分別為＜0.01和＜0.05)。AFL+FSP組與AFL組比較，血清中TG和TC的水平顯著下降(P＜0.05);HDLC水平下降，但未見統(tǒng)計學差異；LDLC的水平則顯示升高(P＜0.05)。AFL+FSP組血清中HDLC的仍顯著高于正常對照組(P＜0.05)。
　　 2、FSP對小鼠肝功能的影響
　　 FSP

12、處理C57BL/6小鼠后，小鼠血清中肝功能的檢測結(jié)果為：用FSP處理C57BL/6小鼠后，小鼠血清肝功能的檢測結(jié)果為：AFL組血清中GOT、GPT和TBil水平均顯著高于正常對照組(P值均＜0.01)。AFL+FSP組血清中GOT和GPT的水平較AFL組顯著下降(P值分別為＜0.05和＜0.01)，但仍顯著高于正常對照組(P值分別為＜0.05和＜0.01);TBil的水平不僅明顯低于AFL組(P＜0.01)，而且基本降至正常對照組水平(

13、P＞0.05)。
　　 3、FSP對小鼠肝組織形態(tài)學的影響
　　 組織切片HE染色可見，對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞排列規(guī)則成條索狀，在中央靜脈周圍呈放射狀分布，肝細胞胞漿均勻，偏嗜酸性；AFL組小鼠肝小葉界限不清，肝細胞索排列紊亂，胞漿內(nèi)可見大小不等、數(shù)量不一的微小脂滴空泡（脂肪變性）；AFL+FSP組的肝細胞排列較整齊，肝細胞內(nèi)脂滴較少，脂肪變性比AFL組明顯減輕。
　　 4、FSP對小鼠肝細胞存活率的影

14、響
　　 利用MTS檢測試劑盒測定各組肝細胞的存活率，從細胞培養(yǎng)至第6小時開始，每隔12小時作為一個細胞存活率的檢測時間點，結(jié)果顯示在84h內(nèi)各時間點AFL+FSP組肝細胞存活率均高于AFL組。在此之后細胞存活率開始下降，提示在一定時間內(nèi)FSP具有促進肝細胞增殖和維持肝細胞存活率的作用。
　　 5、FSP對肝組織內(nèi)TNF-a、IL-6和IL-10的mRNA表達水平影響
　　 通過Real Time-PCR技術(shù)檢測

15、了小鼠肝組織內(nèi)TNF-a、IL-6和IL-10的mRNA表達水平，結(jié)果為：AFL組與正常對照組比較，小鼠肝組織內(nèi)TNF-a的mRNA表達水平有所升高，IL-6和IL-10的mRNA水平有所降低，但均未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。AFL+FSP組與AFL組比較，TNF-a、IL-6和IL-10的mRNA表達水平分別有所下降和升高，但均未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。AFL+FSP組TNF-a的mRNA表達水平較正常對照組也明顯下降(P＜

16、0.05)。
　　 6、FSP對脾細胞培養(yǎng)上清中TNF-a、IL-6和IL-10含量的影響
　　 經(jīng)FSP處理后，利用ELISA法檢測小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中TNF-a、IL-6和IL-10含量，結(jié)果為：AFL組與正常對照組比較，TNF-a和IL-6的水平顯著升高(P值均＜0.01)，IL-10水平也顯示升高，但未見統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。AFL+FSP組與AFL組比較，TNF-a的水平明顯下降(P＜0.01)，可降至正

17、常對照組所測得的水平；IL-6和IL-10的水平也顯示下降，但未見統(tǒng)計學差異；AFL+FSP組IL-6水平仍明顯高于正常對照組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、FSP能夠降低酒精性脂肪肝小鼠體內(nèi)血脂水平，改善受損肝功能。
　　 2、FSP能夠促進肝細胞增殖，使酒精損傷的肝組織形態(tài)得到明顯改善。
　　 3、FSP可以下調(diào)血清TNF-a和IL-6水平，從而遏制小鼠酒精性脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展；對IL-1