模擬微重力狀態(tài)下過氧化物酶體增殖物激活受體γ基因表達對成骨分化的影響.pdf

1、背景：
　　 微重力又稱零重力，是相對于地球表面1g重力環(huán)境而言的一種“零重量”狀態(tài)，也是人類在太空工作及生活所處的環(huán)境。人類長時間處于微重力狀態(tài)下可引起各種病理生理變化，其中包括骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、免疫功能下降等，而骨質(zhì)疏松癥是其中最常見、最嚴重的并發(fā)癥之一。據(jù)報道，空間飛行中平均每月出現(xiàn)2％的骨丟失，相當(dāng)于絕經(jīng)后婦女1年的骨丟失，且返回地面后骨丟失持續(xù)存在，這嚴重影響到飛行員健康。國內(nèi)外現(xiàn)有研究認為，微重力誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥主

2、要發(fā)病機制是空間飛行導(dǎo)致成骨細胞(OB)形狀及結(jié)構(gòu)明顯改變，細胞多呈現(xiàn)濃縮核或核分散，由于重力作用而導(dǎo)致破骨細胞活化引起骨吸收增加，成骨細胞完整性及礦化結(jié)節(jié)形成功能缺失?，F(xiàn)有的藥物、物理治療未能起到理想的治療效果，極大地限制了今后的航天載人事業(yè)發(fā)展及人類長期在太空工作、生活。為探求其他防治失重性骨質(zhì)疏松的方法，模擬微重力下骨代謝及細胞信號通路的研究已經(jīng)成為國內(nèi)外航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點課題之一。
　　 1990年Issemann[2]

3、等首先發(fā)現(xiàn)了一類能被脂肪酸樣化合物過氧化物酶體增殖劑(peroxisome proliferators，PP)激活，而被命名為PP激活受體(peroxisomeprolifemtor-activated receptor，PPAR)。PPAR是一類廣泛參與糖脂調(diào)節(jié)、脂肪儲存基因表達的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族成員。在兩棲類、嚙齒類及人類PPARs由于基因的啟動子和拼接方式不同均存在3種亞型，即PPAR a、PPARβ（亦稱PPARδ或

4、NUC-1）和PPARγ。PPARγ主要表達于脂肪組織，在胰島B細胞、血管內(nèi)皮細胞及巨噬細胞也有表達，已被公認在調(diào)控脂肪細胞分化與糖、脂肪及能量等多種代謝中起重要作用，其基因位于染色體3p25。PPARγmRNA含有9個外顯子，基因組DNA全長約100 kb，存在著4種異構(gòu)體即PPARγ-1、PPARγ-2、PPARγ-3和PPARγ-4。近年來有研究發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）還與激活蛋白21(AP21)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與

5、轉(zhuǎn)錄激活子1(STAT1)、Fos蛋白家族成員δFosB蛋白、細胞周期素D等因子及Wnt信號通路協(xié)同作用調(diào)控細胞的分化、生長和凋亡，其中包括骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)分化過程。PPARγ信號通路可通過激活或關(guān)閉下游信號調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)分化方向，即增加或減少干細胞向成骨細胞分化，從而調(diào)節(jié)成骨細胞數(shù)量。骨髓間充質(zhì)干細胞，具有多向分化潛能，可分化為成骨細胞、脂肪細胞、成軟骨細胞、肌細胞和神經(jīng)細胞等[3-5]。
　　

6、 噻唑烷二酮類藥物作為PPARγ細胞信號通路的人工合成受體，在極低劑量下（毫微克分子）即可激活PPARγ細胞信號通路。吡格列酮作為噻唑烷二酮類藥物代表之一，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于糖尿病治療，選取其作為實驗用PPARγ細胞信號通路激動劑，更具有臨床意義。GW9662是PPARγ細胞信號通路常用的抑制劑，其效果被國內(nèi)外實驗所肯定而廣泛應(yīng)用于抑制PPARγ細胞信號通路。
　　 本實驗設(shè)計將骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合于微載體上，在模擬微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系

7、統(tǒng)(RCCS)中進行向成骨細胞分化誘導(dǎo)，通過激活及抑制PPARγ通路，檢測骨髓間充質(zhì)干細胞在成骨分化過程中所受的影響。期望本實驗結(jié)果為骨質(zhì)疏松癥的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制進一步積累科學(xué)依據(jù)及提供可能的新治療方向。
　　 目的：
　　 觀察過氧化物酶體增殖物激活受體γ細胞通路在體外模擬微重力狀態(tài)下對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的影響及吡格列酮、GW9662對氧化物酶體增殖物激活受體γ基因表達的影響。
　　 對象和方法：<

8、br>　　 1.BMSCs的分離、培養(yǎng)、擴增:取材5周齡SD大鼠股骨及脛骨骨髓作BMSCs原代培養(yǎng)，沖出的骨髓細胞懸液裝入預(yù)先準備的15ml離心管，室溫下以1000r/min離心5min，棄上清、脂肪及雜質(zhì)，F(xiàn)12/DMEM重懸，洗滌細胞;用含有10％胎牛血清的DMEM/F12重懸細胞，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)液(10％FCS、青霉素G100U/ml，鏈霉素100U/ml的DMM/F12培養(yǎng)基)，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱

9、中培養(yǎng)。依據(jù)貼壁培養(yǎng)法分離和進行細胞傳代，取第4-5代骨髓間充質(zhì)干細胞作為研究對象。
　　 2.BMSCs性質(zhì)鑒定:采用流式細胞儀進行檢測細胞表面CD29、CD34、CD44分子表達并繪制成流式圖。
　　 3.實驗分組:實驗分為:正常重力組(NG)、模擬微重力組(MG)、模擬微重力+10μmol/L吡格列酮組(MG+PIO)、模擬微重力+10μmol/LGW9662組(MG+GW)、模擬微重力+10μmol/L吡格列酮+

10、10μmol/L GW9662組(MG+PIO+GW)。正常重力組在正常重力下以貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)14d，模擬微重力組和模擬微重力+吡格列酮和（或）GW9662組均在旋轉(zhuǎn)式重力反應(yīng)器中模擬微重力培養(yǎng)14d。細胞培養(yǎng)14d后，實驗組均用2ml0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA溶液在37℃下消化1-2min，離心收集OB進行檢測。
　　 4.觀察各組14d后使用茜素紅染色檢測成骨結(jié)節(jié)、細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性檢測、油紅-O染色檢測脂肪細

11、胞及計算成脂率、兩步法RT-PCR（半定量反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)）檢測PPARγ基因的mRNA表達情況。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標準差(x±S）表示，多組均數(shù)比較采用完全隨機設(shè)計資料的方差分析，描述性統(tǒng)計分析單因素方差分析(One Way) ANOVA及LSD方法進行多樣本均數(shù)兩兩比較，方差齊性采用Levene檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：

12、r>　　 1.BMSCs生長情況:原代大鼠BMSCs接種后，細胞形態(tài)大小不一，呈圓型。24小時換液后，細胞貼壁生長3d，可觀察到成纖維細胞樣的細胞集落，細胞伸出長短不一，粗細不均的突起，胞漿豐富，胞核大，核仁清晰，每隔兩天在無菌條件下進行全量換液以祛除雜質(zhì)。7至9d后細胞呈集落生長，呈同向旋渦狀排列。10至12d后細胞排列緊密，逐漸融合成片。進行細胞傳代純化培養(yǎng)，每隔3至4d科傳代一次，連續(xù)傳代4-5代后，細胞生長旺盛，形態(tài)均一，呈梭

13、形生長，胞漿豐富，細胞核明顯，每個細胞有一兩個核仁。
　　 2.BMSCs性質(zhì)鑒定:采用流式細胞儀檢測細胞表面CD分子表達，結(jié)果顯示CD29(99.52％)、CD34(0.58％)、、CD44(41.88％)，鑒定結(jié)果顯示出間充質(zhì)干細胞的特性，CD34間充質(zhì)干細胞表面標志抗原表達陰性，而CD29、CD44間充質(zhì)干細胞表面標志抗原表達陽性。以上結(jié)果與李曉峰[6]等結(jié)果一致，可證實其為大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。同時將BMSCs加入成骨細

14、胞分化誘導(dǎo)液，進行成骨誘導(dǎo)分化鑒定。
　　 3.成骨細胞的鑒定:經(jīng)成骨誘導(dǎo)液連續(xù)分化培養(yǎng)14d后，茜素紅染色后在倒置顯微鏡下可見細胞內(nèi)紅色或褐色礦化結(jié)節(jié)。模擬微重力組視野內(nèi)礦化結(jié)節(jié)較正常重力組減少，模擬微重力+吡格列酮組視野內(nèi)礦化結(jié)節(jié)較微重力組明顯減少，細胞排列紊亂，模擬微重力+GW9662組視野內(nèi)可見礦化結(jié)節(jié)較模擬微重力組輕微增多，模擬微重力+吡格列酮+GW9662組視野內(nèi)礦化結(jié)節(jié)較模擬微重力組增加，與模擬微重力+GW9662

15、組相比減少。
　　 4.堿性磷酸酶(ALP)活性檢測:與正常重力組相比，模擬微重力培養(yǎng)的細胞堿性磷酸酶活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，模擬微重力培養(yǎng)的實驗組別堿性磷酸酶活性降低。與模擬微重力組相比，模擬微重力+吡格列酮組的細胞堿性磷酸酶活性較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，模擬微重力+GW9662組的細胞堿性磷酸酶活性較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。與模擬微重力+吡格列酮組相比，模擬微重力+GW9662組

16、及模擬微重力+吡格列酮+GW9662組的細胞堿性磷酸酶活性較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 5.脂肪細胞的鑒定及成脂率計算:與正常重力組相比，模擬微重力培養(yǎng)的細胞中脂肪細胞數(shù)量及成脂率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，模擬微重力培養(yǎng)的實驗組別成脂率升高。與模擬微重力組相比，模擬微重力+吡格列酮組及模擬微重力+GW9662組的成脂率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，模擬微重力+吡格列酮組成脂率升高，模擬微重力+GW9

17、662組的成脂率降低。與模擬微重力+吡格列酮組相比，模擬微重力+GW9662組及模擬微重力+吡格列酮+GW9662組的成脂率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，均低于模擬微重力+吡格列酮組。
　　 6.OB的PPARγ的mRNA的表達:RT-PCR結(jié)果顯示:與正常重力組相比，模擬微重力組及模擬微重力+吡格列酮組PPARγ的mRNA表達均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與模擬微重力+吡格列酮組相比，模擬微重力組、模擬微重力+

18、吡格列酮組及模擬微重力+吡格列酮+GW9662組PPARγ的mRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.“全骨髓貼壁培養(yǎng)法”培養(yǎng)原代培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞是一種科學(xué)有效、簡單可靠的骨髓間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)、純化和擴增方法。
　　 2.體外模擬微重力培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，降低成骨分化率，并增加干細胞向脂肪細胞分化幾率，打破成骨細胞和脂肪細胞之間平衡，使骨基質(zhì)形成、

19、成熟和礦化作用降低，上調(diào)了PPARγ基因的mRNA表達。
　　 3.吡格列酮可以進一步減少骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，促進干細胞向脂肪細胞分化，加重骨基質(zhì)形成、成熟和礦化的障礙，并上調(diào)PPARγ基因的mRNA表達。
　　 4.GW9662可以部分逆轉(zhuǎn)模擬微重力狀態(tài)對骨髓間充質(zhì)干細胞分化成成骨細胞的抑制作用，抑制脂肪細胞生成，下調(diào)PPARγ基因的mRNA表達。
　　 5.PPARγ細胞信號通路的激活可能是造成模