老年神經(jīng)退行性疾病與癌癥相關標志物的表面等離子體激元共振與電化學研究.pdf

1、阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease，AD)由于患病率高、早期癥狀不明顯成為老年神經(jīng)退行性疾病中研究較多的一種。目前普遍認為AD發(fā)病的主要原因是淀粉粥樣蛋白（amyloid-beta，Aβ）的產(chǎn)生和清除失衡。因此，Aβ及其相關蛋白的研究可為AD預防及治療提供重要信息。癌癥是另外一種威脅人類健康的重大疾病?；颊唧w液（如尿液、血液、唾液、腦脊液）中生物標志物的濃度變化能反應疾病的發(fā)生、發(fā)展進程。因此，疾病標志物的檢測可為疾病

2、的預警、早期診斷以及后續(xù)治療提供重要依據(jù)。
　　表面等離子體激元共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是發(fā)生在金屬和電介質(zhì)界面的一種物理現(xiàn)象。通過檢測芯片表面折射率或厚度變化研究生物分子之間的相互作用。電化學技術通過檢測電極表面電活性物質(zhì)的氧化還原而實現(xiàn)待測物質(zhì)的定性及定量分析。電化學測定時需要電活性物質(zhì)進行標記，而SPR檢測具有實時、免標記的特點，兩種技術在一定程度上具有互補性。電化學與SPR都具有靈

3、敏度高、選擇性好、耗樣量少、并適于復雜體系分析等特點，在生命科學領域中具有廣泛的應用前景。
　　本文采用SPR與電化學方法對AD及膠質(zhì)瘤的重要標志物進行了定量及定性研究。具體工作如下:
　　1.采用雙通道SPR對AD的重要標志物Aβ(1-42)及其結(jié)合蛋白TTR進行了研究。將特異性捕獲腦脊液(CSF)中Aβ(1-42)和TTR的抗體分別固定在SPR兩個通道上，隨后流動注射Aβ(1-42)與TTR標準溶液或腦脊液樣品與復合物(

4、由親和素和Aβ(1-16)抗體組成）的混合溶液并記錄SPR信號。該方法對Aβ(1-42)和TTR的檢測限分別為4.7pM和1.1nM。且二者在AD病人腦脊液中的濃度均低于健康人。兩種生物標志物的同時檢測為AD的預警及早期診斷提供了重要依據(jù)。此外，確定了CSF中Aβ(1-42)與TTR的作用形式。
　　2.采用可再生的Ni2+-NTA傳感芯片建立了連續(xù)篩選β-分泌酶(BACE1)抑制劑的SPR方法。抑制劑存在下BACE1的活性被抑制

5、，導致BACE1無法剪切芯片表面的多肽，此時流動注射能識別多肽片段的抗體會產(chǎn)生較大的SPR信號;當BACE1的活性保持時，可被抗體識別的多肽片段被BACE1切割，導致抗體無法結(jié)合到芯片表面，結(jié)果觀察不到SPR信號。該方法簡單、快速、靈敏、檢測通量高。通過該方法篩選出兩種潛在的BACE1抑制劑，其半抑制濃度(IC50)與酶聯(lián)免疫法(ELISA)和質(zhì)譜等結(jié)果一致。
　　3.利用二茂鐵覆蓋的納米金-親和素復合物進行信號放大建立了電化學篩

6、選BACE1抑制劑的方法。當BACE1的活性被抑制時，同樣觀察不到任何電化學信號。該方法可用于BACE1活性的檢測以及篩選BACE1抑制劑的研究。
　　4.通過納米金信號放大建立了靈敏檢測癌癥標志物miRNA的電化學方法。生物素標記的miRNA（與靶點miRNA具有相同的序列）與靶點miRNA和電極表面固定的DNA探針發(fā)生競爭反應，隨后通過生物素與親和素的相互作用在電極表面引入二茂鐵覆蓋的納米金-親和素復合物。通過測定二茂鐵的電化