獼猴桃細菌性潰瘍病菌gacA基因的克隆及功能分析.pdf

1、丁香假單胞獼猴桃致病變種(Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa)引起的細菌性潰瘍病是獼猴桃生產(chǎn)上一種毀滅性細菌性病害，該病害于1980年首次發(fā)現(xiàn)在美國加利福尼亞和日本靜岡縣，隨后蔓延至新西蘭、意大利、中國等地，此病害的流行給獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成重大的經(jīng)濟損失。gacA基因是一類廣泛存在于革蘭氏陰性細菌中的調(diào)控因子，調(diào)控著細菌的毒性及次生代謝產(chǎn)物。Psa在寄主選擇類型及致病流行條件方面與其他丁香假

2、單胞細菌具有很大差異，然而，至今關(guān)于gacA基因在獼猴桃潰瘍細菌致病中的作用機制尚未見報道。因此本研究根據(jù)已知的丁香假單胞番茄致病變種(P. s. pv. tomato)中調(diào)控基因 gacA的序列,利用生物信息學(xué)手段,從獼猴桃潰瘍菌的全基因組中克隆出 gacA基因的同源基因。然后采用同源重組的方法構(gòu)建 gacA基因的缺失突變體及回復(fù)突變體，并對其功能進行初步分析。研究內(nèi)容如下：
　　1.獼猴桃潰瘍病菌gacA基因的克隆及生物信息學(xué)

3、分析根據(jù)來源于假單胞菌屬（Pseudomonas syringae）、芽孢桿菌屬（Bacillus Cohn）、黃單胞菌屬（Xanthomonas Campestris）、歐文氏菌屬（Erwinia amylovora）已報道的gacA基因，利用CLUSTALX軟件進行序列分析，分析結(jié)果表明假單胞菌屬中g(shù)acA基因高度同源，相似性達98％。以獼猴桃潰瘍病菌野生型菌株AHP-18為供試菌株，根據(jù)假單胞菌屬中g(shù)acA基因的保守序列，設(shè)計特異

4、性引物gacA3/gacA4,克隆得到gacA基因，測序驗證正確后，在NCBI上對測序結(jié)果進行分析。
　　利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)對Psa的GacA蛋白序列的進行結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果表明，Psa中GacA具有 GacA相似蛋白的結(jié)構(gòu)，GacA蛋白的 N端具有一個 REC結(jié)構(gòu)域,主要作用是接受信號感受蛋白傳遞來的磷酸基團；C端具有HTH結(jié)構(gòu)，負責(zé)多極化以及和啟動子DNA結(jié)合。

5、r>　　2.獼猴桃潰瘍病菌gacA基因缺失突變體的構(gòu)建及篩選采用同源雙交換的方法對獼猴桃潰瘍病菌的 gacA基因進行缺失突變，首先設(shè)計特異性引物（gac-1U/gac-1R、gac-2U/gac-2R)擴增出 gacA基因的上下游同源臂片段，為了降低篩選突變株的難度，同時引入氯霉素抗性片段然后采用融合PCR技術(shù)構(gòu)建融合片段作為外源目的片段，測序驗證正確后，與自殺載體pK18mobsacB相連，構(gòu)建重組載體pK18gacA。本研究基于三親

6、結(jié)合技術(shù)將重組載體轉(zhuǎn)入野生型菌株 AHP-18中，經(jīng)過同源單交換，得到260株 gacA基因單交換菌株，從單交換菌株中篩選得到雙交換菌株20株，即為 gacA基因的缺失突變株。
　　3.ΔgacA功能互補菌株的構(gòu)建及篩選設(shè)計特異性引物對（gac-F/gac-R)從菌株 AHP-18擴增出要補入的基因片段，并且在片段兩端同時引入合適的酶切位點（PstI/BamHI),將擴增的外源片段及廣宿主質(zhì)粒pLAFR3分別酶切，然后以3:1進行

7、連接，構(gòu)建互補重組載體，然后基于三親結(jié)合技術(shù)將重組載體導(dǎo)入突變株△gacA基因組中，利用四環(huán)素抗性篩選得到陽性克隆，然后進行菌落PCR驗證，正確的即為互補菌株。
　　4.獼猴桃潰瘍病菌gacA基因的功能分析將野生型菌株、突變型菌株及恢復(fù)突變株分別接種獼猴桃活體枝條、離體葉片和煙草葉片，研究gacA基因的生物學(xué)功能。試驗結(jié)果表明，gacA基因參與調(diào)控了病菌的毒素和胞外酶合成，病菌的游動能力及致病性等，該基因的缺失導(dǎo)致病菌的產(chǎn)phas