EpCAM與雄激素非依賴(lài)性前列腺癌發(fā)生的相關(guān)性研究.pdf

1、雄激素抵抗性前列腺癌是前列腺癌致死的主要原因。關(guān)于雄激素抵抗性前列腺癌發(fā)病機(jī)制的研究目前已經(jīng)成為前列腺癌研究的熱點(diǎn)之一。上皮細(xì)胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是一類(lèi)I型跨膜糖蛋白,其在正常組織中只局限性的表達(dá)在上皮組織的基底膜處,但在快速增殖的腫瘤細(xì)胞中則大量表達(dá)。EpCAM在腫瘤組織中的過(guò)度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān),已經(jīng)成為腫瘤診斷和靶向治療重要的候選分子。關(guān)于E

2、pCAM在前列腺癌組織中的表達(dá)與雄激素抵抗性前列腺癌的發(fā)生相關(guān)性的研究目前還鮮有報(bào)道。
　　本研究利用免疫組織化學(xué)和前列腺癌組織芯片技術(shù)在6例正常前列腺組織、24例前列腺增生組織及210例前列腺癌組織中檢測(cè)了EpCAM蛋白的表達(dá)差異。結(jié)果顯示:EpCAM蛋白在正常前列腺組織表達(dá)量較低且主要局限性表達(dá)在前列腺管腔上皮細(xì)胞的基底膜處,在管腔上皮的細(xì)胞間連接處僅有極少量表達(dá)。在前列腺增生組織中,EpCAM的表達(dá)量增高,其表達(dá)不僅在管腔上

3、皮組織的基底膜處且在管腔上皮細(xì)胞間連接處表達(dá)量也較高。在前列腺癌組織中,EpCAM的表達(dá)量顯著升高,且彌散的表達(dá)在前列腺管腔上皮細(xì)胞的各個(gè)部分,除了上皮細(xì)胞的基底部和細(xì)胞間連接處有大量的表達(dá)以外,在管腔上皮細(xì)胞的頂端也有大量的表達(dá)。Western-blot在前列腺癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中檢測(cè) EpCAM的表達(dá),結(jié)果進(jìn)一步肯定了其在前列腺癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示:EpCAM蛋白的高表達(dá)與前列腺癌的臨床病理分級(jí)、

4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及手術(shù)前血清中總的前列腺特異性抗原(Prostatespecific antigen,PSA)水平等具有明顯相關(guān)性,且EpCAM高表達(dá)的前列腺癌患者,其無(wú)轉(zhuǎn)移生存期和總生存期均顯著短于EpCAM低表達(dá)的前列腺癌患者。
　　Western-blot檢測(cè)四種前列腺癌細(xì)胞系DU-145,PC-3,LNCaP及VCaP中EpCAM的表達(dá),結(jié)果顯示:LNCaP細(xì)胞中EpCAM的表達(dá)量最高,其次為PC-3細(xì)胞、DU-14

5、5細(xì)胞和VCaP細(xì)胞。采用shRNA干擾技術(shù)即利用EpCAM-shRNA慢病毒顆粒及相應(yīng)的慢病毒shRNA載體顆粒感染前列腺癌LNCaP細(xì)胞并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系EpCAM-shRNA5和對(duì)照細(xì)胞系Vector3。在EpCAM-shRNA5和Vector3細(xì)胞中分別檢測(cè)雄激素受體(Androgen receptor,AR)及PSA的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:EpCAM-shRNA5細(xì)胞中,AR和PSA的表達(dá)水平明顯低于Vector3細(xì)胞。EL

6、ISA法檢測(cè)EpCAM-shRNA5細(xì)胞培養(yǎng)上清中的PSA水平同樣低于Vector3細(xì)胞。MTT法、TUNEL法、Annexin V/PI雙染法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn)分別用來(lái)在體外檢測(cè)EpCAM-shRNA5和Vector3細(xì)胞的增殖、抗凋亡、遷移以及侵襲能力,結(jié)果顯示EpCAM-shRNA5細(xì)胞的增殖、抗凋亡、遷移以及侵襲能力均顯著低于對(duì)照組Vector3細(xì)胞。采用小鼠體內(nèi)腫瘤種植模型進(jìn)一步在體內(nèi)檢測(cè)兩種細(xì)胞的腫瘤形

7、成能力,結(jié)果顯示EpCAM-shRNA5細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力明顯低于Vector3細(xì)胞。我們的研究結(jié)果提示:EpCAM在前列腺癌組織中的過(guò)度表達(dá)可能通過(guò)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞中AR的表達(dá)來(lái)使得前列腺癌細(xì)胞能夠適應(yīng)去勢(shì)雄激素水平而繼續(xù)存活。
　　對(duì)EpCAM-shRNA5和Vector3細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)可以觀察到Vector3細(xì)胞與 LNCaP細(xì)胞相比形態(tài)變化不大,即均為紡錘狀,并有細(xì)絲狀的偽足,細(xì)胞間連接幾乎不存在。而EpCAM-shR

8、NA5細(xì)胞形態(tài)則由細(xì)長(zhǎng)的紡錘狀變?yōu)檩^規(guī)則的卵石狀,細(xì)絲狀偽足消失,且細(xì)胞間出現(xiàn)了比較稀疏的細(xì)胞間連接。這些形態(tài)變化提示EpCAM的表達(dá)可能促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)。進(jìn)一步在EpCAM-shRNA5和Vector3細(xì)胞中檢測(cè)EMT發(fā)生相關(guān)的蛋白標(biāo)志物,結(jié)果顯示:與Vector3細(xì)胞相比EpCAM-shRNA5細(xì)胞中上皮細(xì)胞特異性蛋白E-cadherin和Cytoker

9、atin的表達(dá)增高而間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白Vimentin和Fibronectin表達(dá)降低。利用免疫熒光染色法進(jìn)一步肯定了EpCAM可促進(jìn)EMT的發(fā)生。由于EMT的發(fā)生會(huì)賦予細(xì)胞干細(xì)胞的特性,同時(shí)EpCAM在一些腫瘤組織中也被看作干細(xì)胞的標(biāo)記物。因此,我們進(jìn)一步驗(yàn)證EpCAM-shRNA5和Vector3細(xì)胞是否具有干細(xì)胞方面的特性。首先,利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩種細(xì)胞的克隆形成能力,結(jié)果顯示:EpCAM-shRNA5細(xì)胞的克隆形成能力顯

10、著低于Vector3。進(jìn)一步檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子OCT4,SOX2,NANOG的表達(dá),結(jié)果顯示:EpCAM-shRNA5細(xì)胞中三種干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平明顯低于Vector3細(xì)胞。提示EpCAM不僅可以通過(guò)上調(diào)AR水平來(lái)提高前列腺癌細(xì)胞對(duì)去勢(shì)水平雄激素的耐受,同時(shí)還可以通過(guò)促進(jìn) EMT的發(fā)生及腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性的表達(dá)來(lái)提高前列腺癌細(xì)胞在去勢(shì)水雄激素平下的生存能力。
　　綜上所述,我們的研究首次將EpCAM在前列腺組織中