ADAMTs-5在腰椎軟骨終板退變中的表達變化及其機制研究.pdf

1、背景和目的：
　　慢性下腰痛是目前最常見的疾病之一，并成為致殘的重要原因。它已造成極大的社會經(jīng)濟負擔。慢性下腰痛的主要原因是椎間盤退變。作為最大的無血管器官，髓核和內(nèi)層纖維環(huán)所需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)是通過軟骨終板(CEP)的擴散提供的。軟骨終板是位于椎間盤上下緣薄薄一層厚度小于1毫米軟骨，在脊柱局部的生物力學和生化功能中扮演非常重要的角色。軟骨終板的退行性變可導致低養(yǎng)分供應、低氧張力、乳酸堆積，從而誘導椎間盤變性。因此，軟骨終板退變與

2、椎間盤變性和下腰痛息息相關。
　　椎體終板及軟骨下骨在磁共振成像(MRI)上信號強度的變化是脊柱退行性疾病中的一種常見現(xiàn)象。1988年，Modic總結(jié)了這些變化，稱他們?yōu)镸odic改變(Modicchanges，MCs)，并分為三種類型。Ⅰ型，在T1加權(quán)像上顯示為低信號，T2加權(quán)像上相對正常終板顯示為高信號，組織病理學表現(xiàn)為組織水腫和血管化增加;Ⅱ型，在T1加權(quán)像上為高信號，T2加權(quán)像上表現(xiàn)為等信號或輕度高信號，組織病理學表現(xiàn)為紅

3、骨髓被黃骨髓取代;Ⅲ型，在T1加權(quán)像及T2加權(quán)像上均表現(xiàn)為低信號，組織病理學表現(xiàn)為骨質(zhì)硬化。盡管Modic改變的原因和病理生理學尚不清楚，但是多數(shù)學者認為炎癥介質(zhì)可能在軟骨終板退化中起著重要的作用。Crock認為髓核中的炎癥因子彌漫可能導致軟骨終板的炎癥反應，從而繼發(fā)退變。在兩個臨床研究中發(fā)現(xiàn)，化學髓核溶解術后鄰近終板發(fā)生了Modic改變。Ohtori等發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子(TNF)陽性的免疫反應性細胞在伴有Modic改變的軟骨終板明顯比

4、MRI正常的軟骨終板多。然而，到目前為止，關于軟骨終板變性的炎癥機制的研究還很少。
　　基于上述的觀察，我們假設IL-1β參與軟骨終板退變中ADAMTS-5的表達，且通過NF-κB途徑上調(diào)終板軟骨細胞的ADAMTS-5表達。通過以下實驗來驗證這個假設:分析伴Modic改變的人腰椎軟骨終板中ADAMTS-5的表達水平及其與IL-1β表達的相關性;通過牛終板軟骨細胞的體外實驗，研究IL-1β對終板軟骨細胞的ADAMTS-5表達的刺激作

5、用，及其調(diào)控機制。
　　方法：
　　1. 使用geNorm、 NormFinder和BestKeeper三種軟件篩選出在Modic改變(MCs)腰椎軟骨終板細胞中表達最為穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參，對qRT-PCR進行標準化。
　　所有腰椎軟骨標本選自各種腰椎疾患而行椎體間融合術的患者。軟骨終板有MCs的患者納入到MCs組，沒有MCs的歸為對照組。MCs組和對照組分別有來自12個患者的樣本。兩組間患者的的年齡、性別相匹配，

6、無統(tǒng)計學差異。從既往文獻中常用的管家基因及關于骨性關節(jié)炎軟骨的基因芯片表達數(shù)據(jù)中選取12個備選基因。終板軟骨的RNA提取依照Untergasser所述方法進行操作。逆轉(zhuǎn)錄采用ReverseTRanscription System試劑金Reverse Transcription System。 qRT-PCR采用GoTaqqRCP Master Mix試劑盒操作完成。每個樣本Ct值的數(shù)據(jù)分析采用3個基于微軟Excel平臺的宏程序:即geN

7、orm，NormFinder和BestKeeper。這些統(tǒng)計算法被用來評估12個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，并確定Modic改變腰椎軟骨終板細胞中最適合作內(nèi)參的管家基因，對qRT-PCR進行標準化。
　　2. 確定腰椎軟骨終板退變中ADAMTS-5表達的變化及其與IL-1β的相關性
　　所有腰椎退行性軟骨終板標本選自因伴Modic改變的下腰痛疾患而行椎體間融合術的患者，納入到MCs組。沒有下腰痛病史而因胸腰椎爆裂性骨折需病椎和相鄰

8、椎間盤切除并植骨重建的患者納入到對照組。組織學分析伴Modic改變的軟骨終板(CEP)中細胞外基質(zhì)蛋白表達的變化。RNA提取和qRT-PCR技術分析軟骨組織退變相關的細胞外基質(zhì)、ADAMTS和IL-1β的mRNA在MCs組和對照組兩者間的表達差異。免疫組織化學方法研究兩組CEP中ADAMTS-4，ADAMTS-5和IL-1β各自的免疫反應陽性的細胞百分數(shù)。用Spearman相關系數(shù)(Spearmanρ test)方法，從mRNA表達及免

9、疫反應陽性細胞的百分率兩個方面，分析腰椎軟骨終板退變中ADAMTS-5表達與IL-1β之間的相關性。
　　3. 通過牛終板軟骨細胞的體外實驗，明確IL-1β能促進終板軟骨細胞ADAMTS-5表達，并通過NF-κB信號通路來調(diào)控ADAMTS-5的表達
　　用qRT-PCR技術，免疫細胞化學方法，Western Blot等多種分子生物技術，檢測IL-1β對牛終板軟骨細胞中ADAMTS-5表達的刺激效應。應用Western Blo

10、t分析IL-1β對牛終板軟骨細胞的NF-κB信號通路的激活作用。并通過應用NF-κB抑制劑SN50阻斷IL-1β對牛終板軟骨細胞ADAMTS-5表達的刺激，反向證實IL-1β通過NF-κB信號通路上調(diào)ADAMTS-5的表達。
　　結(jié)果：
　　1. 12個備選內(nèi)參基因的Ct值范圍為從17.6(18S rRNA)到33.5(ACTB)。在GeNorm分析中，M值最小的為SDHA和B2M(0.45)，因此它們是表達水平最穩(wěn)定的兩個

11、基因。按照表達水平穩(wěn)定性從最高到最低進行排序，具體順序為SDHA=B2M＞LDHA＞TBP＞GUSB＞GAPDH＞IPO8＞HMBS＞ACTB＞HPRT1＞18SrRNA＞RPL13A。在NormFinder分析中，所有樣本中最穩(wěn)定的基因是LDHA，其M值為0.102，隨后依次為SDHA、 B2M、GUSB、GAPDH、IPO8、HMBS、ACTB、TBP、18S rRNA、HPRT1和RPL13A。在BestKeeper分析中，SDH

12、A和ACTB的CV±SD值最小，因此被認為是所有樣本中表達最穩(wěn)定的兩個基因。SDHA是所有樣本中表達最穩(wěn)定的單個基因，而SDHA、B2M和LDHA則是最佳的聯(lián)合內(nèi)參基因選擇。
　　2. MCs組表現(xiàn)為軟骨細胞外基質(zhì)(ECM)纖維化、硬化，以及軟骨細胞密度顯著降低。并可觀察到細胞肥大、集群和呈現(xiàn)多種細胞形態(tài)。番紅O-固綠染色顯示MCs組PG含量明顯減少。細胞外基質(zhì)的基因表達水平的qRT-PCR檢測中， MC組的Ⅱ型膠原的mRNA表達

13、水平較對照組明顯降低（P＜0.05）;MC組中ADAMTS-5mRNA表達與對照組相比顯著增加（P＜0.05）。免疫組織化學實驗顯示，MC組ADAMTS-5免疫檢測陽性的細胞百分比明顯高于對照組(P＜0.01)。而MC組中ADAMTS-4mRNA表達水平和免疫檢測陽性的細胞百分率只較對照組稍微增加而無統(tǒng)計學意義。在mRNA表達及免疫反應陽性細胞的百分率兩個方面，Spearman相關系數(shù)（Spearmanρ test）分析均證實腰椎軟骨終

14、板退變中IL-1β表達增強與ADAMTS-5高水平表達之間呈正相關。
　　3. IL-1β能上調(diào)牛終板軟骨細胞的ADAMTS-5的mRNA和蛋白表達水平。經(jīng)IL-1β(10 ng/mL)作用48小時后，RT-PCR和Western Blot分別顯示牛終板軟骨細胞ADAMTS-5的mRNA和蛋白表達水平均顯著增加（P＜0.01）。免疫細胞化學的方法發(fā)現(xiàn)IL-1β作用以后，ADAMTS-5蛋白陽性的牛終板軟骨細胞數(shù)及細胞內(nèi)ADAMTS

15、-5蛋白的熒光強度較與對照組顯著增強。在(10 ng/mL)IL-1β作用15min后，牛終板軟骨細胞的p-p65的蛋白濃度明顯升高， IκB-α的蛋白濃度明顯降低，而p65在始終基本保持不變。IL-1β對牛終板軟骨細胞ADAMTS-5表達的刺激作用可以被NF-κB抑制劑SN50(50微克/毫升)有效阻斷。
　　結(jié)論：
　　1. 這是第一個為確保腰椎終板軟骨細胞中基因表達水平評估的可靠性而選擇合適內(nèi)參基因的研究。我們的研究發(fā)

16、現(xiàn)在所有樣本中，表達最穩(wěn)定的基因是SDHA，聯(lián)合采用SDHA、B2M和LDHA作為內(nèi)參基因，可以獲得更為精準的結(jié)果。
　　2. 伴Modic改變的腰椎終板軟骨細胞中ADAMTS-5mRNA表達水平較正常軟骨終板有顯著增加，而ADAMTS-4表達水平無明顯改變。ADAMTS-5mRNA表達水平與IL-1β表達呈正相關，提示IL-1β可能選擇性地上調(diào)終板軟骨細胞ADAMTS-5的表達。
　　3. 我們的研究首次證實，IL-1β可