miR-10a對肝癌細胞遷移、侵襲的影響及其靶基因的確定.pdf

1、目的:
　　 腫瘤的遷移和侵襲是多基因參與、多步驟完成的復(fù)雜生命現(xiàn)象，其發(fā)生的隱蔽性和不可預(yù)測性是腫瘤患者治療過程中最重要的難題，也是威脅腫瘤患者生命的最重要原因。目前，對于其發(fā)生機制的研究已取得了很多的成就，microRNA(miRNA)的發(fā)現(xiàn)又使這一領(lǐng)域的研究有所擴展。miRNA屬于小RNA分子家族，能通過與3'非翻譯區(qū)(3'UTR)帶有互補序列的靶基因互補結(jié)合，引起靶基因mRNA的降解或翻譯抑制，從而發(fā)揮對靶基因表達的調(diào)控

2、作用。研究表明，miRNA的調(diào)節(jié)作用涵蓋了生長發(fā)育，細胞凋亡，造血細胞分化，脂肪代謝等多種生命過程。在腫瘤組織中，也存在miRNA的差異表達，提示人們miRNA可能參與腫瘤的某些生物學(xué)特性的形成。此研究的目的即探尋是否miRNA參與了肝癌細胞遷移和侵襲的調(diào)控過程，這一調(diào)控過程是通過哪些基因?qū)崿F(xiàn)的。
　　 方法:
　　 本實驗室的前期工作表明miR-10a是抑制結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移的重要miRNA，其可能是通過調(diào)節(jié)MMP14的表

3、達來發(fā)揮作用。為了研究miR-10a對肝癌細胞遷移及侵襲能力的影響，我們進行了深入的研究。細胞遷移及侵襲實驗中，過表達或封閉掉miR-10a后，細胞的遷移及侵襲能力發(fā)生了變化。同時用MTT，平板克隆形成實驗檢測了miR-10a對細胞活性及增殖能力的影響。在確認miR-10a與肝癌細胞遷移及侵襲表型相關(guān)之后，我們通過生物信息學(xué)方法預(yù)測其靶基因，挑選了其中一個與腫瘤轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)的靶基因EPHA4為研究對象。在接下來的實驗中，我們構(gòu)建了帶

4、有EPHA4的3'UTR miR-10a靶位點的報告基因載體，在肝癌細胞系中檢測miR-10a對報告基因表達水平的影響，來驗證EPHA4是否為miR-10a的靶基因。此后，又通過Real-time PCR和Western blot方法檢測了miR-10a對EPHA4的mRNA和蛋白水平的影響。構(gòu)建的質(zhì)粒pSilenser/EPHA4-shRNA對細胞表型的影響，進一步驗證EPHA4是否為miR-10a的靶基因。
　　 結(jié)果:

5、r>　　 細胞遷移及侵襲實驗的結(jié)果表明，過表達miR-10a能促進肝癌細胞的遷移和侵襲，封閉掉miR-10a能降低肝癌細胞的遷移和侵襲能力，且并不影響細胞的活性及增殖能力。報告基因載體實驗表明miR-10a能夠抑制帶有EPHA4靶位點的報告基因表達載體的表達。Real-time PCR和Western blot的結(jié)果表明miR-10a能夠影響EPHA4的mRNA和蛋白水平。pSilenser/EPHA4-shRNA質(zhì)粒對細胞表型的影響