弓形蟲重組抗原P22的制備及應(yīng)用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:應(yīng)用基因重組技術(shù)獲敏感性、特異性高的弓形蟲速殖子主要表面抗原P22的融合蛋白,應(yīng)用于弓形蟲感染免疫學(xué)診斷.方法:采用PCR方法,以弓形蟲RH株DNA為模板,擴(kuò)增編碼主要表面抗原P22的基因片段.將該基因片段插入T/A克隆,經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定,獲陽性克隆加以擴(kuò)增,試劑盒抽提陽性克隆.雙酶切后純化目的片段,再將其與原核表達(dá)載體pET-32a按一定比例在T4連接酶的作用下重組.用PCR結(jié)合雙酶切的方法鑒定,核酸測序驗(yàn)證.將構(gòu)建好

2、的原核表達(dá)載體pET-32a/P22轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21中,用一定濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE觀察表達(dá)效果,Western blot對融合蛋白進(jìn)行鑒定.將重組菌表達(dá)產(chǎn)物溶于尿素中,通過親和層析的方法得到P22蛋白,以分步洗滌和透析等方法逐步洗脫尿素,純化產(chǎn)物經(jīng)氧化/還原型谷胱苷肽復(fù)性后即為重組蛋白.以該蛋白作抗原,與弓形蟲粗抗原比較檢測弓形蟲感染兔血清和其他各種疾病患者血清.結(jié)論:成功獲得重組抗原P22,以此作抗原檢測弓形蟲

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